Fluorescence intensity profiles of in situ hybridization signals depict genome architecture within human interphase nuclei

Abstract

An approach towards construction of two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) profiles of interphase chromatin architecture by quantification of fluorescence in situ hybridization (FISH) signal intensity is proposed. The technique was applied for analysis of signal intensity and distribution within interphase nuclei of somatic cells in different human tissues. Whole genomic DNA, fraction of repeated DNA sequences (Cot1) and cloned satellite DNA were used as probes for FISH. The 2D and 3D fluorescence intensity profiles were able to depict FISH signal associations and somatic chromosome pairing. Furthermore, it allowed the detection of replicating signal patterns, the assessment of hybridization efficiency, and comparative analysis of DNA content variation of specific heterochromatic chromosomal regions. The 3D fluorescence intensity profiles allowed the analysis of intensity gradient within the signal volume. An approach was found applicable for determination of assembly of different types of DNA sequences, including classical satellite and alphoid DNA, gene-rich (G-negative bands) and gene-poor (G-positive bands) chromosomal regions as well as for assessment of chromatin architecture and targeted DNA sequence distribution within interphase nuclei. We conclude the approach to be a powerful additional tool for analysis of interphase genome architecture and chromosome behavior in the nucleus of human somatic cells.

Представлено метод побудови двомірних (2D) та тримірних (3D) профілів інтенсивності сигналів флуоресцентної гібридизації in situ (FISH), що заснований на кількісній FISH. Наведена методика була використана для аналізу розташування та розподілу сигналів в інтерфазних ядрах клітин різних соматичних тканин людини. Використання 2D профілів інтенсивності продемонструвало можливість визначення локалізації FISH-сигналів. Більш того, даний підхід дозволив ідентифікувати репліковані сигнали, дати оцінку ефективності гібридизації та провести порівняльний аналіз варіації вмісту ДНК специфічних ділянок хромосом. Побудова 3D профілів показала розподіл інтенсивності у межах площі сигналу. Використання цієї методики дозволило визначити зосередження різних типів послідовностей ДНК: класична сателітна та альфоїдна ДНК; генонасичені (G-позитивні полоси) і геноненасичені (G-негативні полоси) ділянки хромосом. Крім цього, методика надала можливість оцінити розташування хроматина в інтерфазних ядрах як культивованих, так і некультивованих клітин. Зроблено висновок, що наведений підхід є ефективною додатковою методикою для вивчення ядерної організації, специфіки варіації та розташування послідовностей ДНК в інтерфазних ядрах, а також поведінки ядер при приготуванні хромосомних препаратів соматичних клітин людини.

Представлен метод построения двухмерных (2D) и трехмерных (3D) профилей интенсивности сигналов флюоресцентной гибридизации in situ (FISH), основанный на количественной FISH. Настоящая методика была использована для анализа расположения и распределения сигналов в интерфазных ядрах клеток различных соматических тканей человека. Использование 2D профилей интенсивности продемонстрировало возможность определения колокализации FISH-сигналов. Более того, предложенный подход позволил идентифицировать реплицированные сигналы, дать оценку эффективности гибридизации и сравнительный анализ вариации содержания ДНК специфических участков хромосом. Построение 3D профилей показало распределение интенсивности в пределах площади сигнала. Применение этой методики позволило определить сосредоточение различных типов последовательностей ДНК: классическая сателлитная и альфоидная ДНК; геннонасыщенные (G-положительные полосы) и генноненасыщенные (G-отрицательные полосы) участки хромосом. Кроме того, методика дала возможность оценить расположение хроматина в интерфазных ядрах как культивированных, так и некультивированных клеток. В результате исследования был сделан вывод о том, что предлагаемый подход является эффективной дополнительной методикой для изучения ядерной организации, специфики вариации и расположения последовательностей ДНК в интерфазных ядрах, а также поведе- ния ядер при приготовлении хромосомных препаратов соматических клеток человека.