Реакційна здатність металотіонеїнів та ефективність їх метал-депонуючої та антиоксидантної функцій у адаптації риби Carassius carassius до природного забруднення

Abstract

Металотіонеїни (МТ) є стресорними білками з метал-депонуючою та антиоксидантною функціями, співвідношення між якими у тварин в природних умовах існу- вання не з’ясоване. Для визначення ефективності цих функцій у риб за умов комплексного забруднення середовища визначали хроматографічну поведінку та концентрацію МТ за вмістом металів (Ме-МТ) та тіолів (SH-МТ) в печінці та зябрах карася (Carassius carassius) з двох місцевостей весною, влітку та восени. Вимірювали також концентрацію глутатіону (GSH), супероксид-аніону (O2 • ) та карбонільних похідних білків (КПБ). Згідно факторного і кореляційного аналізів сезонна залежність показників риб домінувала в печінці, а просторова була більше виражена у зябрах. Восени спостерігали збільшення об’єму ізоформи MT-2/2a та частки міді у складі металів МТ. При порівнянні реакційної здатності SH-груп реконструйованих α- та β-доменів МТ карася встановлено, що вона вища у Cu-β-домену. Тому високий вміст тіолів SH-МТ та GSH у поєднанні з малими значеннями вмісту O2 • , КПБ та Ме-МТ у карася із забрудненої водойми восени, особливо в зябрах, трактуємо як свідчення ослаблення метал-депонуючої здатності МТ на користь антиоксидантної функції Cu-МТ. Мікроядерний тест підтвердив відсутність токсичного ефекту на риб у забрудненій місцевості. Ключові слова: Carassius carassius, металотіонеїни, антиоксидантний захист, природне забруднення.

Crucian carp Carassius carassius is a hardy fish, which is widely distributed in fresh waters and whose feeding habits expose it to many different types of environmental contaminants. It is known to be especially well equipped for metabolic depression, and the gills plays an important role in this tolerance. It is the only adult vertebrate known to have this ability. However, the molecular stress-related processes in the tissues of crucian carp are studied scant and mainly under the effect of separate toxic substances in the laboratorial studies. Metallothioneins (MTs) are stress-proteins with metal-keeping and antioxidant functions, which parity in animals from field conditions is unclear. Since the synthesis of MTs is often induced when organisms are exposed to heavy metals, especially Cd, MTs are proposed to be a specific “biomarker” responsive to metal pollution in aquatic animals, including fish. The aim of this study was to appreciate the variability of responses of MTs in the crucian carp from mixed polluted environment. For that, the chromatographic behaviour and MTs concentration were determined as their metal (Me-MT) and thiol (SH-MT) contents in the liver and gills of fish from two sites in spring, summer and autumn. Sites near the springs of the river (comparatively clean) and downstream of the river (polluted) were selected. To elucidate the contribution of the temporal and spatial factors in the variability of the responses of antioxidative defence system, the glutathione (GSH), superoxide-anion (O2• ) and protein carbonyls (PC) concentrations were determined. The Gel-filtration of the thermostable solutions from both liver and gills of crucian carp on Sephadex G-75 revealed peak identified as MT-containing peak based upon its spectral features, thermostability, and low molecular weight, apparently of 7 – 8 kDa. The anion-exchange liquid chromatography on DEAE cellulose of the thermostable solution demonstrated two chromatographic forms, constant MT-1 (0,24 М NaCl) and variable MT-2/2a (0,39 М NaCl/0,32 М NaCl). The content of metals in the composition of MTs ranged at 7 – 25 nmol/g of tissue for the copper, 80 –120 nmol/g of tissue for the zinc, and 1 – 12 nmol/g of tissue for the cadmium. Especially significant differences of the content of separate metals and general content of Ме-МТ between the two groups were shown in the gills. These differences were opposite in spring and autumn. The elevation of the value of MT-2/2a form in autumn and the increase of the part of the copper compare to the zinc in the metal composition of MTs from spring to autumn was detected. It was particularly prominent in MT-2/2a and in the fish from polluted site. The separate domains of the MTs of crucian carp were isolated. Incubation of Cd-enriched MTs with EDTA and subtilisin produced α-domain, whilst the preferential binding of Cu(I) to the β domain of the apothionein and the tolerance toward proteolysis of the Cu(I) bound domain permit the isolation of β-domain. In order to characterize the reactivity of the cysteinyl groups in separate domains, we studied their reactions with 5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (Ellman’s reagent). By the comparison of the reactivity of SH-groups in rebuilded α- and β-domains of MTs, higher reactivity of Cu-β-domain was established. According to Principal Component and correlative analyses, seasonal dependence of studied indices predominated in the liver, and spatial dependence was better revealed in the gills. Micronuclear test showed comparatively low level of nuclear abnormalities in fish from both sites. Nevertheless, the high levels of thiols, SH-MT and GSH, jointly with low O2 • , PC and Me-MT levels were shown in the tissues of fish from polluted site in autumn, especially in gills. The integrated index of antioxidant-prooxidant state was calculated. It showed significantly higher antioxidative potential in the tissues of fish from polluted site compare to counterpart in autumn, especially in the gills. Based on the peculiarities of MTs and their separated domains features, high level of antioxidative defence in the fish from polluted site was explained as the benefit of antioxidant function of Cu-MT combined with the manifestation of the weakening of the metal-binding function, particularly toward Zn. Key words: Carassius carassius, metallothionein, antioxidative defense, field pollution.

Металлотионеины (МТ) – это стрессорными белки с металл-депонирующей и антиоксидантной функциями, соотношение которых у животных из естественных водоемов нe изучалось. Для оценки эффективности этих функций у рыб в условиях комплексного загрязнения среды определяли хроматографическое поведение и уровень МТ по содержанию в них металлов (Me-MT) и тиоловых групп (SHMT) в печени и жабрах карася (Carassius сarassius) из двух местностей весной, летом и осенью. Также определяли уровень глутатиона (GSH), супероксид-аниона (O2 • ) и карбонильных производных белков (КПБ). Согласно результатов факторного и корреляционного анализов, в печени преобладала сезонная зависимость показателей, а в жабрах более проявлялась зависимость от местности. Осенью наблюдали увеличение объема изоформы MT-2/2a и доли меди в составе металлов МТ. Сравнение реакционной способности SH-групп реконструированных α- и β-доменов МТ показало что Сu-β-домен обладает более высокой реакционной способностью. Таким образом, высокое содержание тиолов SH-MT и GSH согласованно с низким уровнем O2 • , КПБ и Me-МТ в тканях карася из загрязненной местности, особенно в жабрах, объясняем как признак ослабления металл- депонирующей функции МТ в пользу антиоксидантной функции Cu-МТ. Результаты микроядерного теста подтвердили отсутствие токсического воздействия на рыбу в загрязненной местности. Ключевые слова: Carassius carassius, металлотионеины, антиоксидантная защита, естественное загрязнение.