Разработка системной оптимизации протоколов криоконсервирования клеточных суспензий

Abstract

Эффективное криоконсервирование клеточных суспензий является важной задачей криобиологии. На основании предыдущих исследований была разработана методика системной оптимизации протоколов криоконсервирования клеточных суспензий. В качестве клеточной модели использовали кератиноциты человека. Исследование включало 48 протоколов с различными скоростями охлаждения (B) в двухступенчатых режимах (B1 в диапазоне от 4 до –30°С и В2 от –30 до –80°С). Все протоколы изучали при четырех различных концентрациях наиболее часто применяемого криопротектора диметилсуфоксида (ДМСО). Растровый анализ около 600 образцов позволил изучить полный набор возможных переменных. В дальнейших исследованиях данная методика была использована для улучшения протоколов криоконсервирования HPMEC-ST1.6R (легочные микрососудистые эндотелиальные клетки человека). Результаты исследования показали, что только определенное оптимальное сочетание скоростей охлаждения обеспечивает высокий уровень выживаемости клеток после оттаивания. Для кератиноцитов человека оптимальными протоколами замораживания были: охлаждение со скоростью 5 К/мин для B1 и 7,5 К/мин для В2, либо 5 К/мин для B1 и 10 K/мин для В2 при концентрации ДМСО 2,5%. Наиболее высокие показатели выживаемости культуры клеток HPMEC-ST1.6R были достигнуты при использовании следующих протоколов: 5 K/мин (B1) в сочетании с 5 K/мин (B2) (7,5% ДМСО); 3 К/мин в сочетании с 3 К/мин (5 или 7,5% ДМСО); 10 K/мин (B1) в сочетании с 3 К/мин (B2) (10% ДМСО).

Ефективне кріоконсервування клітинних суспензій є важливим завданням кріобіології. На підставі попередніх досліджень була розроблена методика системної оптимізації протоколів кріоконсервування клітинних суспензій. У якості клітинної моделі використовували кератиноцити людини. Дослідження включало 48 протоколів з різними швидкостями охолодження (B) в двоступінчастих режимах (B1 в діапазоні від 4 до –30°С і В2 від –30 до –80°С). Усі протоколи вивчали при чотирьох різних концентраціях кріопротектора диметилсульфоксиду (ДМСО), який вживається найбільш часто. Растровий аналіз близько 600 зразків дозволив вивчити повний набір можливих змінних. У подальших дослідженнях дана методика була використана для поліпшення протоколів кріоконсервування HPMEC-ST1.6R (легеневі мікросудинні ендотеліальні клітини людини). Результати дослідження показали, що тільки певне оптимальне поєднання швидкостей охолодження забезпечує високий рівень виживання клітин після відтавання. Для кератиноцитів людини оптимальними протоколами заморожування були: охолодження зі швидкістю 5 К/хв для B1 і 7,5 К/хв для В2 або 5 К/хв для B1 і 10 K/хв для В2 при концентрації ДМСО 2,5%. Найбільш високі показники виживаності культури клітин HPMEC-ST1.6R були досягнуті при застосуванні наступних протоколів: 5 K/хв (B1) у поєднанні з 5 K/хв (B2) (7,5% ДМСО); 3 К/хв у поєднанні з 3 К/хв (5 або 7,5% ДМСО); 10 K/хв (B1) у поєднанні з 3 К/хв (B2) (10% ДМСО).

Effective cryopreservation of cellular suspensions is an important task of cryobiology. A systematic parameter optimization setup for cryopreservation of cellular suspensions was established on the basis of our previous studies. Keratinocytes were used as a cellular model. The investigation included 48 protocols with different cooling rates (B) in a two-step freezing protocols (B1 in the range of 4°C to –30°C and B2 from –30°C to –80°C). All protocols have been studied with four different concentrations of the most frequently applied cryoprotective agent dimethyl sulfoxide (DMSO). Raster analysis of approximately 600 samples allowed the detection of the most comprehensive array of possible variables. In further investigations this setup was used to improve the cryopreservation protocols for HPMEC-ST1.6R (human pulmonary microvascular endothelial cells). Results revealed that only an optimal combination of cooling rates ensured the highest survival rates of cells after thawing. In case of keratinocytes, the optimal freezing protocol was composed of the cooling rates of 5 K/min for B1 and 7.5 K/min for B2, or 5 K/min for B1 and 10 K/min for B2 (2.5% DMSO concentration). The highest survival rates of HPMEC-ST1.6R cell culture were achieved with application of the following protocols: 5 K/min (B1) combined with 5 K/min (B2) (7.5% DMSO); 3 K/min, combined with 3 K/min (5% or 7.5% DMSO); and 10 K/min combined with 3 K/min (10% DMSO).