Молекулярні технології в детекції чутливих та стійких до ізоніазиду мікобактерій туберкульозу

Abstract

Розроблено два варіанти детекції однонуклеотидних поліморфізмів у кодоні 315 гена katG мікобактерій туберкульозу (МТБ), мутації в якому асоційовані з резистентністю до ізоніазиду – протитуберкульозного препарату першого ряду. Два набори праймерів, кожний з яких містить додатковий конкурентний блокуючий праймер з 3’­термінальною фосфатною групою (для елімінації неспецифічної ампліфікації), дозволяють у кодоні 315 гена katG виявляти точкові мутації AGC→ACC та AGC→AGA, що найчастіше зустрічаються. Проведення ПЛР з набором із двох праймерів, один з яких містить п’ять LNA­мономерів, дозволяє встановити наявність будь­якого з шести відомих варіантів мутацій у кодоні 315 гена katG, тобто диференціювати чутливі та резистентні до ізоніазиду МТБ. Чистоту та будову праймерів довжиною 17 нуклеотидів, що містять LNA­модифіковані нуклеотиди, охарактеризовано часопролітною мас-спектрометрією з матрично-активованою лазерною десорбцією/іонізацією, а 17­мірний дуплекс, утворений двома комплементарними олігонуклеотидами з LNA­мономерами, – методом термічної денатурації. Створені молекулярно­генетичні тест­системи для виявлення ізолятів дикого типу та резистентних МТБ до протитуберкульозного препарату першого ряду ізоніазиду можуть застосовуватися у клінічних лабораторіях зі стандартним ПЛР­обладнанням та дозволяють скоротити визначення резистентності МТБ до ізоніазиду з 1–3 місяців стандартними бактеріологічними методами до 1–3 днів шляхом ПЛР.

Разработаны два варианта детекции однонуклеотидных полиморфизмов в кодоне 315 гена katG микобактерий туберкулеза (МТБ), мутации в котором ассоциированы с устойчивостью к изониазиду – противотуберкулезному препарату первого ряда. Два набора праймеров, каждый из которых содержит дополнительный конкурентный блокирующий праймер с 3’-терминальной фосфатной группой (для элиминации неспецифической амплификации), позволяют выявлять наличие наиболее часто встречающихся точечных мутаций AGC→ACC и AGC→AGA в кодоне 315 гена katG. Проведение ПЦР с набором из двух праймеров, один из которых содержит пять LNA-мономеров, позволяет определить наличие любого из шести известных вариантов мутаций в кодоне 315 гена katG, т.е. дифференцировать чувствительные и резистентные к изониазиду МТБ. Чистота и строение праймеров длиной 17 нуклеотидов, содержащих LNA-модифицированные нуклеотиды, охарактеризованы времяпролетной масс спектрометрией с матрично активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF), а 17-мерный дуплекс, образованный двумя комплементарными олигонуклеотидами с LNA-мономерами, – методом термической денатурации.

Two types of techniques for detection of single nucleotide polymorphism in 315 codon of katG gene of MTB are developed. Isoniazid resistance of MTB is associated with point mutations in the mentioned codon. Two primer sets with additional competitive blocking primer containing 3’-terminal phosphate group (for elimination of unspecific amplification) allow detecting the most frequent point mutations AGC ��������ACC and AGC ��������AGA in 315 codon of katG gene. PCR with primer set of two primers one of which contains five LNA-monomers allows to determine an occurrence of any type from six known mutations in 315 codon of katG gene, i.e. to differentiate wild type and isoniazid-resistant MTB. Purity and structure of 17 bp long primers with LNA-modified nucleotides were characterized by time-of-flight MALDI-mass spectrometry. Duplex of 17 bp length formed by two complementary oligonucleotides with LNA-monomers was studied using melting.