DNA extraction from old herbarium material of Veronica subgen. Pseudolysimachium (Plantaginaceae)

Abstract

Herbarium specimens have become a major source of information in molecular biodiversity research, framing the term "herbarium genomics". However, obtaining good DNA from old herbarium specimens is still a challenge. Currently, DNA extraction methods from old herbarium material often yield highly degraded and fragmented DNA. A number of studies have discussed such methods, especially how to avoid further DNA fragmentation. This study aims to compare different DNA extraction methods applied to old herbarium material from Veronica subg. Pseudolysimachium. One such method is a CTABbased DNA extraction followed by a clean-up with paramagnetic beads that is used in the Jodrell Laboratory, Royal Botanic Gardens Kew, UK. This method was compared to a modified NucleoSpin Plant II protocol, based on silica columns, as used at the Technical University Munich-Freising, which was already successfully used for extracting DNA from a Linnean type specimen. Further tests were conducted on the influence of incubation time on the CTAB DNA extraction protocol with a subsample of specimens. Our preliminary results suggest that CTAB DNA extraction might have some advantages in specific cases but also that silica column-based methods have fewer problems with contamination by polysaccharides and polyphenolic compounds. Regarding the incubation time, we did not observe a clear pattern, but we developed several ideas on how to proceed with tests to find an optimal DNA extraction protocol to deal with highly fragmented DNA. Taking practical considerations into account, the column-based method proves to be preferable, especially when trying to reduce the amount of leaf tissue used, but further modifications of both methods should be explored.

Гербарні зразки стали важливим джерелом інформації для молекулярних досліджень біорізноманіття, і навіть виник термін "гербарна геноміка". Проте, отримання хороших зразків ДНК зі старих гербарних зразків все ще є складним завданням. На даний час методи екстракції ДНК зі старого гербарного матеріалу часто дозволяють отримати лише деградовану або фрагментовану ДНК. Такі методи обговорювалися у багатьох дослідженнях, зокрема, щодо вирішення проблеми подальшої фрагментації ДНК. Метою нашого дослідження було порівняння різних методів екстракції ДНК зі старих гербарних зразків представників Veronica subg. Pseudolysimachium. Один з цих методів – екстракція ДНК на основі CTAB (цетилтриметиламоній бромід або цетил-триметил-бромід амонію) з наступним очищенням за допомогою парамагнітних гранул, що використовується у Лабораторії Джодрелла у Королівському ботанічному саду К'ю (Велика Британія). Цей метод порівнювався з модифікованою методикою NucleoSpin Plant II на основі силікагелевих колонок, що використовувалася у Технічному університеті Мюнхен-Фрайзінг (Німеччина) і була успішно застосована для отримання ДНК з типового зразка гербарію К. Ліннея. Проводилися подальші тести з вибіркою зразків щодо впливу часу інкубації на методику виділення ДНК за допомогою CTAB. Наші попередні результати свідчать, що CTAB-метод екстракції ДНК може мати певні переваги у конкретних випадках, але також вказують на те, що методи на основі силікагелевих колонок мають менше проблем із забрудненням полісахаридами та поліфенольними сполуками. Ми не виявили певної закономірності щодо часу інкубації, але розробили декілька ідей про те, як рухатися далі з експериментами для виявлення оптимальної методики екстракції ДНК для зразків, що містять фрагментовану ДНК. З практичного погляду, метод на основі колонок виглядає кращим, особливо тоді, коли є потреба зменшити кількість тканини листків. Проте, слід розробляти подальші вдосконалені модифікації обох методів.

Гербарные образцы стали важным источником информации для молекулярных исследований биоразнообразия; возник даже термин "гербарная геномика". Однако получение хороших образцов ДНК из старых гербарных образцов все еще является сложной задачей. В настоящее время методы экстракции ДНК из старого гербарного материала позволяют получить лишь деградированную или фрагментированную ДНК. Такие методы обсуждались во многих исследованиях, в частности, при решении проблемы дальнейшей фрагментации ДНК. Целью нашего исследования было сравнение различных методов экстракции ДНК из старых гербарных образцов представителей Veronica subg. Pseudolysimachium. Один из этих методов – экстракция ДНК на основе CTAB (цетилтриметиламмоний бромид или цетил-триметил-бромид аммония) с последующей очисткой с помощью парамагнитных гранул используется в Лаборатории Джодрелла в Королевском ботаническом саду Кью (Великобритания). Этот метод сравнивали с модифицированной методикой NucleoSpin Plant II на основе силикагелевих колонок, которая использовалась в Техническом университете Мюнхен-Фрайзинг (Германия) и была успешно применена для получения ДНК из типового образца гербария К. Линнея. Дальнейшие тесты проведены с выборкой образцов по влиянию времени инкубации на методику выделения ДНК с помощью CTAB. Наши предварительные результаты свидетельствуют о том, что CTAB-метод экстракции ДНК может обладать определенными преимуществами в конкретных случаях, но также указывают на то, что методы на основе силикагелевих колонок имеют меньше проблем с загрязнением полисахаридами и полифенольными соединениями. Мы не обнаружили определенной закономерности относительно времени инкубации, но разработали несколько идей о том, как двигаться дальше с экспериментами по выявлению оптимальной методики экстракции ДНК для образцов, содержащих фрагментированную ДНК. С практической точки зрения, метод на основе колонок является лучшим, особенно, когда необходимо уменьшить количество ткани листьев. Однако, следует разрабатывать дальнейшие усовершенствованные модификации обоих методов.