Ренатурація химерного білка ScFv-CBD з тілець включення Escherichia соli

Abstract

Запропоновано ефективний і недорогий метод ренатурації химерного білка ScFv-CBD із тілець включення E. coli. Метод грунтується на ступінчастому розведенні солюбілізованого в розчині 6 М гуанідингідрохлориду ScFv-CBD буфером для ренатурації, який містить L-аргінін та глутатіон. Досліджено вплив вихідної концентрації білка та різного співвідношення реагентів окисно-відновної пари GSSG:GSН, які додавали на певних стадіях ренатурації, на вихід функціонально активного ScFv-CBD і його агрегацію. Показано, що зниження виходу активного ScFv-CBD відбувається за рахунок формування значної кількості його розчинних агрегатів при вихідній концентрації, вищій за 0,53 мг/мл. Визначено умови ренатурації, які забезпечують найбільший вихід розчинного ScFv-CBD у мономерній формі, та найвищу функціональну активність його антигензв’язувального (ScFv) і целюлозозв’язувального (CBD) компонентів (відповідно ~63 і ~96 %).

An inexpensive and effective refolding method for ScFv-CBD fusion protein recovery from E. coli inclusion bodies has been developed. The principle of the proposed method is the stepwise dilution of solubilized ScFv-CBD in the presence of 6 M guanidine hydrochloride with refolding buffer containing L-arginine and glutathione. The influence of initial protein concentration and the molar ratio of oxidized and reduced form of glutathione that was introduced at certain refolding stages has been carefully investigated. It was shown that the decrease in the yield of functional ScFv-CBD and formation of significant amount of soluble aggregates take place when the initial protein concentration is higher then 0.53 mg/ml. The optimal refolding conditions providing highest yield of soluble monomeric ScFv-CBD as well as the highest functional activity of antigen-binding (ScFv) and cellulose-binding (CBD) moieties (~63 % and ~96 %, respectively) have been found.

Предложен эффективный и недорогой метод ренатурации химерного белка ScFv-CBD из телец включения E. coli, основанный на ступенчатом разведении солюбилизированного в растворе 6 М гуанидингидрохлорида ScFv-CBD буфером для ренатурации, содержащим L-аргинин и глутатион. Исследовано влияние исходной концентрации белка и разного соотношения реагентов окислительно-восстановительной пары GSSG/GSH, вносимых на определенных стадиях ренатурации, на выход функционально активного ScFv-CBD и его агрегацию. Показано, что снижение выхода активного ScFv-CBD происходит из-за формирования значительного количества его растворимых агрегатов при исходной концентрации выше 0,53 мг/мл. Определены условия ренатурации, обеспечивающие наибольший выход растворимого ScFv-CBD в мономерной форме, а также наивысшую активность его антигенсвязывающего (ScFv) и целлюлозосвязывающего (CBD) компонентов (соответственно ~63 и ~96 %).