Суперсинтез α-2b интерферона человека в клетках Escherichia coli в растворимой форме с использованием системы экспрессии на основе РНК-полимеразы фага Т7

Abstract

Разработана эффективная технология получения растворимого альфа-2b интерферона человека (ИФН) с использованием системы экспрессии на основе РНК-полимеразы фага Т7. Синтезирован­ный для этой цели искусственный ген ИФН клонировали в экспрессионный вектор рЕТ-24а, содержащий Т7 промотор и терминатор. Рекомбинантную плазмиду, обозначенную как рЕТ-αИФН, трансформировали в клетки Escherichia coli BL (DE3) и синтез ИФН индуцировали изопропил-β-D-тиогалактозидом. Изучали влияние температуры (37 и 21 °С) культивирования клеток Е. coli BL (рЕТ-αИФН) на уровень синтеза и выход растворимого ИФН. Установлено, что уровень синтеза рекомбинантного белка в первые часы после индукции при температуре 37 °С выше, чем при 21 °С. Так, через 4 ч после индукции выход ИФН при культивировании продуцента при 37 °С составляет до 20 %, а при 21 °С – только 7 % от суммарных белков клетки. Однако, если ИФН экспрессируется при температуре 37 °С, то он накапливается в клетках в виде нерастворимых телец включений. Показано, что снижение температуры культивирования проду­ цента после индукции способствует накоплению целевого белка в растворимой форме. Увеличение продолжительности культивирования продуцента при температуре 21 °С до 18 ч позволяет получать растворимый ИФН в большем количестве. Разработанная нами технология получения ИФН предусматривает инфицирование фагом лямбда клеток Е. coli BL21 (DE3), содержащих плазмиду с целевым геном под контролем промотора фага Т7. В результате лизиса клеток штамма-продуцента синтезированный целевой белок высвобождается в ростовую среду, где и накапливается в растворимой форме. При оптимальных условиях культивирования 1 л фаголизата содержит около 200 мг растворимого ИФН. Полученный выход ИФН более чем в 2,5 раза выше по сравнению с ранее достигнутым нами выходом растворимого ИФН при использовании в качестве продуцента клеток Е. coli SG30 (pIF-16), несущих плазмиду с двумя копиями искусст­венного гена ИФН под контролем тандема триптофановых промоторов.

Розроблено ефективну технологію одержання розчинного альфа-2b інтерферону людини (ІФН) з використанням системи експресії на основі PHK-полімерази фага Т7. Синтезований для цього штучний ген ІФН клонували в експресійний вектор рЕТ-24а, який містить Т7 промотор и термінатор. Рекомбінантну плазміду, позначену як рЕТ-αIФН, трансформу­ вали в клітини Е. coli BL (DE3) і синтез ІФН індукували ізопропіл-β-D-тіогалактозидом. Вивчали вплив температури (37 и 21 °С) культивування клітин Е. coli BL (рЕТ-αIФН) на рівень синтезу і вихід розчинного ІФН. Встановлено, що рівень синтезу рекомбінантного білка у перші години після індукції при температурі 37 °С вищий, ніж при 21 °С. Так, через 4 год після індукції вихід ІФН при культивуванні продуцента при 37 °С складає до 20 %, а при 21 °С – лише 7 % від сумарних білків клітини. Однак якщо ІФН експресується при темпера­турі 37 °С, то він накопичується в клітинах у вигляді нерозчинних тілець включень. Показано, що зниження темпе­ратури культивування продуцента після індукції сприяє нако­пиченню цільового білка в розчинній формі. Збільшення трива­лості культивування продуцента при температурі 21 °С до 18 год дозволяє одержувати розчинний ІФН у більшій кіль­кості. Розроблена нами технологія отримання ІФН передба­чає інфікування фагом лямбда клітин Е. coli BL21 (DE3), які містять плазміду з цільовим геном під контролем промотора фага Т7. В результаті лізису клітин штамма-продуцента синтезований цільовий білок вивільняється у середовище для росту, де й накопичується у розчинній формі. За оптимальних умов культивування 1 л фаголізату містить біля 200 мг розчинного ІФН. Отриманий вихід ІФН більш ніж у 2,5 разу вищий порівняно з раніше досягнутим нами виходом розчинно­го ІФН при використанні як продуцента клітин Е. coli SG30 (pIF-16), що несуть плазміду з двома копіями штучного гена ІФН під контролем тандема триптофанових промоторів.

An effective technology of soluble human α-2b interferon (IFN) production using the bacteriophage T7 polymerase-base expression system have been developed. For this purpose an artificial gene for human α-2b interferon (IFN) has been chemically synthesized and cloned into the expression vector pET-24a containing T7 promoter and terminator. A recombinant plasmid named pET-alFN was transformed into E. coli BL (DE3) cells and synthesis of the IFN was induced with IPTG. The influence of temperature (37 and 21 °C) of E. coli BL (pET-FαIN) cells cultivation on the level of synthesis and the yield of soluble IFN have been investigated. We found that level of recombinant protein synthesis at 37 °C is higher than at 21 °C in the first hours after induction. Thus, the IFN yield after 4 hour postinduction amounts about 20 % at 37 °C and only 7 % of the total cellular proteins at 21 °C. However, it has been determined that the expression of IFN at 37 °C results in accumulation of recombinant protein in cells as the insoluble inclusion bodies. It was shown that the lower temperature promotes accumulation of target protein in a soluble form and that soluble IFN can be produced in E. coli BL (pET-αlFN) cells in higher amounts by postinduction cultivation at 21 °C during 18 h. The technology of IFN production developed by us includes the phage lambda infection of E. coli BL21 (DE3) cells, containing a plasmid with a target gene under the T7 phage promoter. The process results in lysis of the producer strain cells and releasing newly synthesized target protein into the growth medium, where it accumulates in a soluble form. Under the optimal cultivation conditions 1 liter of phage lysate contains about 200 mg of a soluble IFN. The obtained yield of soluble IFN is more than 2,5 times higher compared to the previously achieved yield of a soluble IFN using as a producer E. coli SG30 (pIF-16) carrying the plasmid with the two copies of an artificial gene for IFN under the control of the Ptrp tandem promoter.