Expression and secretion of human recombinant LIF by genetically modified mammalian cells

Abstract

Aim. The aim of this work was to express the human LIF gene in mammalian cells and to study the secretion of recombinant LIF into culture medium. Methods. Recombinant LIF was detected by Western blot analysis and immunoprecipitation in culture medium of CHO-K1, L-M (TK– ) (ins+ ), 293Ò cells, transfected with recombinant plasmids containing human LIF gene. Results. The recombi- nant plasmids. containing human gene LIF, were constructed. The cells of three (CHO-K1, L-M (TK– ) (ins+ ), 293Ò) mammalian lines were transfected with these plasmids. It was shown that the transfected mammalian cells secreted recombinant human LIF which was characterized by variable degree of glycosylation including completely glycosylated form (approximately 68 kD). Ñonclusions. The conditioned medium of developed cell lines can be used as a sourñe of human recombinant LIF for different purposes, including purification of human recombinant LIF and as an additional supplement for cell culturing. Keywords: recombinant LIF, expression, secretion, transfection, cell lines.

Цель работы состояла в получении экспрессии гена LIF человека в генетически модифицированных клетках млекопитающих и изучении секреции рекомбинантного белка этими клетками в культуральную среду. Методы. Для выявления рекомбинантного LIF в кондиционированной среде, полученной в результате культивирования клеток, трансфецированных рекомбинантными плазмидами, содержащими ген LIF, использовали Вестерн-блот-анализ и иммунопреципитацию. Результаты. Сконструированные рекомбинантные плазмиды обеспечивают експрессию и секрецию рекомбинантного LIF человека клетками трех линий (CHO-K1, L-M(TK– )(ins + ) и 293Т), трансфецированными этими плазмидами. Степень гликозилирования продуцируемого такими клетками рекомбинантного LIF варьирует, при этом наблюдается секреция полностью гликозилированного LIF (с молекулярной массой около 68 кДа). Выводы. Кондиционированную среду, полученную вследствие культивирования трансфецированных клеток, можно использовать как источник LIF человека для культивирования клеток, нуждающихся в этом ростовом факторе, и для его выделения в чистом виде. Ключевые слова: рекомбинантный LIF, экспрессия, секреция, трансфекция,клеточные линии

Мета. Мета роботи полягала в одержанні експресії гена LIF людини в генетично модифікованих клітинах ссавців і вивченні секреції рекомбінантного білка цими клітинами в культуральне середовище. Методи. Для визначення рекомбінантного LIF в кондиціонованому середовищі, одержаному в результаті культивування клітин, трансфекованих рекомбінантними плазмідами, що містять ген LIF, використовували Вестернблот аналіз та імунопреципітацію. Результати. Сконструйовані рекомбінантні плазміди забезпечують експресію і секрецію рекомбінантного LIF людини клітинами трьох ліній (CHOK1, L-M(TK– )(ins + ) і 293Т), трансфекованих цими плазмідами. Ступінь глікозилювання рекомбінантного LIF, продукованого такими клітинами, варіює, при цьому спостерігається секреція повністю глікозильованого LIF (з молекулярною масою близько 68 кДа). Висновки. Кондиціоноване середовище, одержане внаслідок культивування трансфекованих клітин, можна використовувати як джерело LIF людини для культивування клітин, яким потрібен цей ростовий фактор, а також для його виділення в очищеному стані. Ключові слова: рекомбінантний LIF, експресія, секреція, трансфекція, клітинні лінії.