Конструювання штамів — надпродуцентів формальдегіддегідрогенази метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha

Abstract

Для генно-інженерного конструювання надпродуцента глутатіонзалежної формальдегіддегідро­генази (ФдДГ) обрано термотолерантні метилотрофні дріжджі Н. polymorpha NCYC 495 (leul-l). Ген FLD1 з власним промотором введено у плазміду інтегративного типу pYTl, яка містила ген LEU2 Saccharomyces cerevisiae, з подальшим включенням цього гена у геном штаму-реципіента leul-I. Здійснено селекцію інтегративних трансформантів за ознаками прототрофності по лейцину та резистентності до підвищених концентрацій формальдегіду (до 15 мМ) у ростовому середовищі. Визначено оптимальні умови культивування штамів для досягнення максимального рівня синтезу ФдДГ. Відібрано кращий трансформант як перспективний продуцент ФдДГ з активністю до 4 мкмоль·хв⁻¹· мг⁻¹ білка у безклітинному екстракті.

Для генно-инженерного конструирования сверхпродуцента глутатионзависимой формальдегиддегидрогеназы (ФдДГ) выбра­ны термотолерантные метилотрофные дрожжи Н. polymor­pha NCYC 495 (leul-1). Ген FLD1 с собственным промотором был введен в плазмиду интегративного типа pYTl, содержа­щую ген LEU2 Saccharomyces cerevisiae, с последуюищм вклю­чением целевого гена в геном штамма-реципиента leul-1. Проведена селекция интегративных трансформантов по при­знакам прототрофности по лейцину и резистентости к повы­шенным концентрациям формальдегида (до 15 мМ) в росто­вой среде. Определены оптимальные условия культивирования штаммов для достижения максимального уровня синтеза ФдДГ. Выбран лучший трансформант как перспективный продуцент ФдДГ (с активностью до 4 мкмоль·мин⁻¹ ·мг⁻¹ белка в бесклеточном экстракте).

The thermotolerant methylotrophic yeast H. polymorpha NCYC 495 (leu1-1) was chosen for genetic construction of the strain, over-producing glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase (FdDH). FLD1 gene with its own promoter was inserted into an integrative plasmid pYT1 containing LEU2 gene of Saccharomyces cerevisiae (as a selective marker) and the constructed vector was used for multi-copy integration of the target gene into genome of leu1-1 recipient cells. Selection of the strains was carried out by leucine prototrophy, as well as by resistance to elevated concentrations of formaldehyde in the medium (up to 15 mM). The optimal cultivation conditions for the selected strains were established which resulted in maximal synthesis of the target enzyme. The best recombinant strain was chosen as a perspective over-producer of FdDH (with the protein activity of 4 mmoles × min⁻¹ ×mg⁻¹ in cell-free extract).