Разработка стратегии получения рекомбинантных одноцепочечных антител против поверхностных клеточных биомаркеров на примере антигена CD34 человека

Abstract

Антитела против поверхностных клеточных белков выполняют важную функцию в процедурах детектирования, определения стадии дифференциации и выделения целевых популяций клеток. Поверхностные клеточные антигены часто имеют сложную структуру внеклеточного участка молекулы, характеризующуюся сильным гликозилированием и стабилизированную дисульфидными связями. При этом получение антител против таких белков является нетривиальной задачей. Цель. Разработать стратегию получения рекомбинантных антител против поверхностных клеточных биомаркеров. Методы. Конструирование библиотеки кДНК генов VH и VL иммуноглобулинов животных, иммунизированных рекомбинантным антигеном, и использование биопеннинга на антиген-позитивных клетках для обогащения исходной библиотеки последовательностями целевых антител. Детектирование и отбор клонов – продуцентов целевых антител осуществляли с помощью высокопродуктивных автоматизированных систем. Результаты. Получена панель из пяти антител, распознающих антиген на поверхности CD34-позитивных клеток. Выводы. Предложенная стратегия может быть использована для получения антител против поверхностных клеточных антигенов.

Антитіла проти поверхневих клітинних білків відіграють важливу роль у процедурах детектування, визначення стадії диференціації та виділення цільових популяцій клітин. Поверхневі клітинні антигени часто мають складну структуру зовнішньоклітинної ділянки молекули, яка характеризується сильним глікозилюванням та стабілізується дисульфідними зв’язками. При цьому одержання антитіл проти таких білків є нетривіальною задачею. Мета. Розробка стратегії одержання рекомбінантних антитіл проти поверхневих клітинних біомаркерів. Методи. Конструювання бібліотеки кДНК генів VH та VL імуноглобулінів тварин, імунізованих рекомбінантним антигеном, та використання біопенінгу на антиген-позитивних клітинах для збагачення вихідної бібліотеки послідовностями цільових антитіл. Детектування та відбір клонів – про дуцентів цільових антитіл здійснювали за допомогою високопродуктивних автоматизованих систем. Результати. Одержано панель з п’яти антитіл, що розпізнають антиген на поверхні клітин CD34+, методами імуноцитохімії та проточної цитометрії. Висновки. Запропоновану стратегію можна використовувати для одержання антитіл проти поверхневих клітинних антигенів.

Antibodies against cell-surface proteins play an important role in cell detection, separation and determination of differentiation stage. The globular structure of extracellular region of cell-surface antigens is frequently characterized by heavily glycosilation and/or is stabilized by disulphide bonds. In this case the obtaining of antibodies against such proteins is a substantive problem. Aim. The development of strategy for obtaining recombinant antibodies against cell-surface biomarkers. Methods. The research strategy is based on the construction of cDNA library of VH and VL genes of animals, immunized with recombinant antigen, and subsequent cell-based bio-panning for the library enrichment with desired phage clones. High-throughput automated systems were used for the detection and isolation of antigen-specific clones. Results. We have obtained a panel of five antibodies that recognize an antigen on CD34+ cell surface using the methods of immunocytochemistry and flow cytometry. Conclusions. The proposed strategy may be used for obtaining antibodies against cell-surface antigens.