http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/151273 Tue, 21 Apr 2026 00:46:59 GMT 2026-04-21T00:46:59Z http://dspace.nbuv.gov.ua:80/bitstream/id/449939/ http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/151273 http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/154376 Optimization of in vitro model for analysis of tumor cell migration dynamics Kravchenko, A.O.; Kosach, V.R.; Shkarina, K.A.; Zaiets, I.V.; Tykhonkova, I.O.; Khoruzhenko, A.I. Migration ability is an important feature of tumor cells. There are several approaches to analyze the dynamics of cancer cell migration in vitro. One of the most perspective and closer to the in vivo conditions is the model of initiation of the cell migration from 3D multicellular spheroids onto growth surface. Aim. Optimization of the model for adequate quantitative characteristics of the tumor cell locomotion during several days. Methods. 2D and 3D MCF-7 cell culture, immunofluorescence analysis, and image analysis using computer software Fiji. Results. Unification of spheroid size allowed avoiding a significant data deviation. The obtained spheroids spread completely for 3 days. The highest migration ratio was observed at the 2nd day. The proliferation level at each of 3-day experiment was the same and did not exceed 3%. The validity of the model was tested after migration inhibition by rapamycin (mTOR signaling inhibitor). Additionally, this model was successfully applied to immunofluorescence analysis, namely investigation of p85S6K1 subcellular localization in moving MCF-7 cells. Conclusions. Double filtration of multicellular spheroids allowed unification of their size, which promotes an adequate interpretation of the migration assay. This model enabled the study of tumor cells migration dynamics and can be further used for the development of anticancer drug.; Міграційна здатність є важливою ознакою пухлинних клітин. Існує кілька підходів до аналізу динаміки міграції ракових клітин in vitro. Однією з найбільш перспективних і близьких до умов in vivo є модель ініціювання міграції клітин з тривимірного багатоклітинного сфероїда на ростову поверхню. Мета. Оптимізація моделі для адекватної кількісної оцінки міграції пухлинних клітин. Методи. 2- та 3-вимірна культура клітин лінії MCF-7, імунофлюоресцентний аналіз, аналіз зображень з використанням комп'ютерної програми Фіджі. Результати. Уніфікація розміру сфероїдів дозволила уникнути значного розкиду даних. Отримані сфероїди повністю розпластувались протягом 3 днів. Найвищий показник міграції спостерігався на 2-гу добу розпластування сфероїда. Рівень проліферації клітин за кожну добу 3-денного експерименту був майже однаковим і не перевищував 3%. Валідність моделі була протестована після пригнічення міграційної активності клітин під впливом рапаміцину (інгібітор сигналізації mTOR). Крім того, запропонована модель була успішно застосована для дослідження субклітинної локалізації p85S6K1 в мігруючих клітинах лінії MCF-7 за допомогою імунофлюоресцентного аналізу. Висновки. Подвійне фільтрування багатоклітинних сфероїдів дозволяє уніфікувати їх розміри, що в подальшому сприяє адекватній оцінці міграційного потенціалу клітин. Запропонована модель дозволяє вивчати динаміку міграційних процесів пухлинних клітин і може бути використана для тестування протипухлинних препаратів in vitro.; Миграционная способность является важной особенностью опухолевых клеток. Существует несколько подходов для анализа динамики миграции раковых клеток in vitro. Одной из наиболее перспективных и приближенных к условиям in vivo является модель инициации миграции клеток из трехмерных многоклеточных сфероидов на поверхность роста. Цель. Оптимизация модели для адекватных количественных характеристик локомоции опухолевых клеток в течение нескольких дней. Методы. 2D и 3D MCF-7 клеточная культура, иммунофлуоресцентный анализ и анализ изображений с использованием компьютерного программного обеспечения Фиджи. Результаты. Унификация размеров сфероидов позволила избежать значительного отклонения данных. Полученные сфероиды распространились полностью за 3 дня. Самый высокий коэффициент миграции наблюдался на 2-й день. Уровень пролиферации в каждом из 3-дневных экспериментов был одинаковым и не превышал 3%. Достоверность модели была проверена после ингибирования миграции рапамицином (ингибитор передачи сигналов mTOR). Кроме того, эта модель была успешно применена для иммунофлуоресцентного анализа, а именно для исследования субклеточной локализации p85S6K1 в движущихся клетках MCF-7. Выводы. Двойная фильтрация многоклеточных сфероидов позволила унифицировать их размер, что способствует адекватной интерпретации анализа миграции. Эта модель позволила изучить динамику миграции опухолевых клеток и может быть в дальнейшем использована для разработки противоопухолевого препарата. Mon, 01 Jan 2018 00:00:00 GMT http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/154376 2018-01-01T00:00:00Z http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/154372 DNA loop organization in glioblastoma T98G cells at their different functional states Afanasieva, K.S.; Semenova, A.Y.; Lukash, L.L.; Sivolob, A.V. The loop domain organization of chromatin, which plays an important role in transcription regulation, may depend on the cell functional state. Aim. To investigate DNA loop reorganization upon functional transitions in the glioblastoma T98G cells. Methods. Single cell gel electrophoresis (a comet assay) was used to analyze the kinetics of the DNA loop migration from the nucleoids obtained from the lysed cells. Results. The cells arrested in the G1 phase of the cell cycle were characterized by a relatively low amount of DNA in the comet tails due to a low content of DNA in the loops which may be resolved by the comet assay (up to ~300 kb). After cell reactivation, the contour length of the loops essentially increased in parallel with a decrease in the linear loop density along the genome. Conclusions. An increase in the loop size and a respective decrease in the loop density may be a general feature of activated cells as we earlier observed similar effects upon activation of human lymphocytes.; Організація петельних доменів хроматину, яка відіграє важливу роль у регуляції транскрипції, напевно може залежати від функціонального стану клітини. Мета. Дослідити можливу реорганізацію петель ДНК при функціональних переходах у гліобластомних клітинах T98G. Методи. Ми застосовували метод електрофорезу ДНК ізольованих клітин (кометний електрофорез) для аналізу кінетики міграції петель ДНК з нуклеоїдів, отриманих з лізованих клітин. Результати. Клітини, заарештовані на фазі G1 клітинного циклу, характеризуються порівняно низьким вмістом ДНК у хвостах комет внаслідок низького вмісту ДНК у складі петель, що знаходяться у межах роздільної здатності кометного електрофорезу (до ~300 кб). Після реактивації клітин контурна довжина петель суттєво зростає, паралельно зі зниженням лінійної щільності петель уздовж геному. Висновки. Оскільки подібні ефекти спостерігались нами раніше для активованих лімфоцитів, ми робимо висновок, що зростання розміру петель та відповідне зниження їхньої лінійної щільності може бути загальною характеристикою активованих клітин.; Организация петельных доменов хроматина, играющая важную роль в регуляции транскрипции, предположительно может зависеть от функционального состояния клетки. Цель. Исследовать возможной реорганизации петель ДНК при функциональных переходах в глиобластомных клетках T98G. Методы. Мы использовали электрофорез ДНК изолированных клеток (кометный электрофорез) для анализа кинетики миграции петель ДНК из нуклеоидов, полученных из лизированных клеток. Результаты. Клетки, арестованные на фазе G1 клеточного цикла, характеризуются сравнительно низким содержанием ДНК в хвостах комет из-за низкого содержания ДНК в составе петель, которые находятся в пределах разрешающей способности кометного электрофореза (до ~300 кб). После реактивации клеток контурная длина петель существенно возрастает, параллельно со снижением линейной плотности петель вдоль генома. Выводы. Поскольку аналогичные эффекты наблюдались нами ранее для активированных лимфоцитов, мы заключили, что возрастание размера петель и соответствующее снижение их линейной плотности может быть общей характеристикой активированных клеток. Mon, 01 Jan 2018 00:00:00 GMT http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/154372 2018-01-01T00:00:00Z http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/154370 Expression and purification of full-length Alanyl-tRNA-synthetase from Thermus thermophilus HB27 Rybak, M.Yu.; Priss, A.E.; Gudzera, O.I.; Kovalchuk, A.O.; Kryklyvyi, I.A.; Tukalo, M.A. Aim. To gain insight into structural and functional properties of alanyl-tRNA,synthetase (AlaRS), we genetically engineered constructs for expression and purification of full-length AlaRS and checked its activity in aminoacylation assays. Methods. The genomic DNA for the AlaS gene from the T. thermophilus (HB 27 strain) was amplified by PCR and cloned into vectors with and without a histidine tag. To optimize conditions for the protein expression in E. coli and to develop efficient purification procedure, the molecular biology techniques were applied. AlaRS was purified by affinity and size-exclusion chromatography. The molecular weight of enzyme was determined by gel filtration. Results. The expression and purification conditions for recombinant AlaRS were optimized. Approximately 1.5 mg of the pure active recombinant enzyme can be obtained from 1 L of bacterial culture. AlaRS from T. thermophilus is a dimer in solution with an experimental MW of 204 kDa. Conclusions. The purified recombinant enzyme will be used for further studies on the functional kinetics and structure of the crystal complex with tRNA.; Мета. Для детального вивчення структурних та функціональних властивостей аланіл-тРНК-синтетази (АлаРС) було створено генно-інженерну конструкцію для експресії та очищення повнорозмірної синтетази та перевірено її активність у реакції аміноацилювання. Методи. Ген AlaS з T. thermophilus (штам HB27) геномної ДНК ампліфікували за допомогою ПЛР з відповідними праймерами та клонували у вектор з та без гістидинової послідовності. Для оптимізації умов експресії білка в E.coli та розробки ефективної процедури очищення були застосовані сучасні методи молекулярної біології. AлаРС очищали методами афінної хроматографії та гель-фільтрації. Молекулярна маса ферменту визначалася на гель-фільтраційній колонці. Результати. Умови експресії та очистки рекомбінантної АлаРС були оптимізовані. Близько 1,5 мг чистого рекомбінантного активного ферменту можна одержати з 1 л бактеріальної культури. АлаРС з T. thermophilus є димером у розчині з експериментальною масою 204 кДа. Висновки. Отриманий рекомбінантний фермент буде використовуватися для подальших експериментів з функціональної кінетики та структурних досліджень кристалічного комплексу з тРНК.; Цель. Для детального изучения структурных и функциональных свойств аланил-тРНК-синтетазы (АлаРС) было создано генно-инженерную конструкцию для экспрессии и очистки полноразмерной синтетазы и проверено ее активность в реакции аминоацилирования. Методы. Ген аlaS из геномной ДНК T. thermophilus (штамм HB27) амплифицировали с помощью ПЦР с соответствующими праймерами и клонировали в вектор с и без гистидиновой последовательностью. Для оптимизации условий экспрессии белка в E. coli и разработки эффективной процедуры очистки были применены современные методы молекулярной биологии. AлаРС очищали методами аффинной хроматографии и гель-фильтрации. Молекулярная масса фермента определялась на гель-фильтрационной колонке. Результаты. Условия экспрессии и очистки рекомбинантной АлаРС были оптимизированы. Около 1,5 мг чистого рекомбинантного активного фермента можно получить с 1 л бактериальной культуры. АлаРС с T. thermophilus является димером в растворе с экспериментальной массой 204 кДа. Выводы. Полученный рекомбинантный фермент будет использован для дальнейших экспериментов с функциональной кинетики и структурных исследований кристаллического комплекса с тРНК Mon, 01 Jan 2018 00:00:00 GMT http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/154370 2018-01-01T00:00:00Z http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/154368 Control of the amount and functionality of the eEF1A1 and eEF1A2 isoforms in mammalian cells Negrutskii, B.S.; Novosylna, O.V.; Porubleva, L.V.; Vislovukh, A.A. Aim. To review mechanisms of regulation of expression and the functionality of two isoforms of translation elongation factor eEF1A in mammalian cells. Results. eEF1A1 and eEF1A2 proteins are regulated by post-translational modifications, protein-protein and protein-tRNA interactions as well as by controlling the amount of their mRNAs in human cells. Conclusions. EEF1A1 mRNA levels in cancer cells may depend on the allelic copy number while the level of EEF1A2 mRNA may be controlled by micro RNAs. eEF1A2 protein activity in different cellular processes may be determined, in part, by its increased affinity for tRNA and viral RNAs as compared to eEF1A1. eEF1A1 activity can be regulated by its increased susceptibility to post-translational modifications (PTM) and protein-protein interactions (PTI) as compared to eEF1A2.; Мета. Представити короткий огляд деяких механізмів, за допомогою яких клітини ссавців контролюють експресію і функціональність двох ізоформ фактора елонгації трансляції eEF1A. Результати. Описано клітинну тактику контроля білків eEF1A1 і eEF1A2 за участі пост-трансляційних модифікацій, білок-білкових та білок-РНКових взаємодій, а також регуляції кількості і стабільності EEF1A1 і EEF1A2 мРНК. Висновки. Рівень мРНК, що кодує еEF1A1 в ракових клітинах, може залежати від зміни кількості алельних копій, у той час, коли рівень EEF1A2 мРНК може контролюватися за допомогою мікро РНК. Активність білка еEF1A2 в різних клітинних процесах, може визначатися, зокрема, підвищеною, в порівнянні з еEF1A1, афінністю до тРНК і вірусної РНК. В свою чергу, активність еEF1A1 може регулюватися підвищеною, в порівнянні з еF1A2, доступністю цього білка до пост-трансляційних модифікацій і білок-білкових взаємодій.; Цель. Представить краткий обзор некоторых механизмов, с помощью которых клетки млекопитающих контролируют экспрессию и функциональность двух изоформ фактора элонгации трансляции еEF1A. Результаты. Описано клеточную тактику контроля белков eEF1A1 и eEF1A2 с участием пост-трансляционных модификаций, белок-белковых и белок-РНКовых взаимодействий, а также регуляции количества и стабильности EEF1A1 и EEF1A2 мРНК. Выводы. Уровень мРНК, которая кодирует еEF1A1 в раковых клетках, может определяться измененным количеством аллельных копий, в то время как уровень мРНК, кодирующей еEF1A2, может контролироваться посредством микроРНК. Активность белка еEF1A2 в разных клеточных процессах может определяться, в частности, его увеличенной, в сравнении с eEF1A1, аффинностью к тРНК и вирусной РНК. В свою очередь, активность eEF1A1 может регулироваться увеличенными, по сравнению с eEF1A2, подверженностью этого белка пост-трансляционным модификациям и доступностью для белок-белковых взаимодействий. Mon, 01 Jan 2018 00:00:00 GMT http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/154368 2018-01-01T00:00:00Z