http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/151256 Tue, 21 Apr 2026 06:22:09 GMT 2026-04-21T06:22:09Z http://dspace.nbuv.gov.ua:80/bitstream/id/449919/ http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/151256 http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/152828 Practical approach to quantification of mRNA abundance using RT-qPCR, normalization of experimental data and MIQE Obolenskaya, M.Yu.; Kuklin, A.V.; Rodrigez, R.R.; Martsenyuk, O.P.; Korneyeva, K.L.; Docenko, V.A.; Draguschenko, O.O. Reverse transcription and quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) has become the most common method for characterizing expression patterns of individual mRNAs due to a large dynamic range of linear quantification, high speed, sensitivity, resolution and cost-effectiveness. However, the complexity of the protocol, variability of reagents, an inconsistent quality of biological samples, and the absence of standardized methods of data quantification may produce inconsistent results. In an effort to to standardize ithe procedure and assure high reliability of data, the minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE) guidelines was defined and further extended by Prof. Bustin and colleagues (2004). These guidelines have been followed by the development of an XML-based real-time PCR data markup language (RDML) and a RDML data base for consistent reporting of RT-qPCR data created by the RDML consortium. Here we follow the RT-qPCR procedure step by step in compliance with MIQE requirements, local facilities and resources and our own experience in application of RT-qPCR methodology.; Реакція зворотної транскрипції і ланцюгової полімеризації в реальному часі (ЗТ-кПЛР) стала найбільш уживаним методом для характеристики профілів експресії індивідуальних мРНК через можливості оцінки концентрацій в широкому діапазоні, відносної швидкості реакції, чутливості, роздільності і відносно невеликої вартості. Однак, багатоступеневий характер реакції, різні реактиви, різна якість біологічних зразків і відсутність стандартних приписів для проведення реакції приховують небезпеку отримати викривлені результати. Для стандартизації кожного з етапів методу і підвищення надійності результатів проф. С. Бустіним із співробітниками [2004] була розроблена методична інструкція, що містила мінімальну інформацію, яка необхідна для публікації результатів, отриманих за допомогою ЗТ-кПЛР. Крім того, RDML консорціумом на основі XML ( розширювана мова розмічання) створені спеціальна мова RDML і база даних RDML для збору і аналізу результатів ЗТ-кПЛР экспериментів. В цій статті ми описуємо весь процес ЗТ-кПЛР по етапах згідно вимог методичної інструкції MIQE і нашим власним досвідом у застосуванні цього методу.; Реакция обратной транскрипции и количественной цепной полимеризации (ОТ-кПЦР) стала наиболее используемым методом для характеристики профиля экспрессии индивидуальных мРНК благодаря широкому диапазону измеряемых концентраций, малой затратности по времени исполнения, чувствительности, разрешающей способности и относительно небольшой стоимости. Однако, многоступенчатый характер реакции, разнообразие используемых реактивов, разное качество биологических образцов и отсутствие стандартных подходов для количественной оценки результатов таит опасность получить искаженные результаты. Для максимальной стандартизации каждого из этапов реакции и повышения надежности результатов проф. С. Бустиным с сотрудниками [2004] была разработана методическая инструкция с указанием минимальной информации (MIQE), необходимой для публикации данных, которые были получены с помощью ОТ-кПЦР. Кроме того, RDML консорциумом на основе XML (расширяемый язык разметки) разработан специальный язык RDML и создана база данных RDML для сбора и анализа результатов ОТ-кПЦР экспериментов. В этой статье мы описываем поэтапно весь процесс ОТ-кПЦР в соответствии с требованиями методической инструкции MIQE и нашим опытом в области применения этого метода. Fri, 01 Jan 2016 00:00:00 GMT http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/152828 2016-01-01T00:00:00Z http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/152827 Intranuclear localization of transcription factories and immunoglobulin heavy chain gene alleles during human B-cell maturation Pichugin, A.V.; Iarovaia, O.V.; Sklyar, I.V.; Lacombe, G.; Razin, S.V.; Fest, T.; Lipinski, M.; Vassetzky, Y.S. Immunoglobulin heavy chain (IGH) gene locus is expressed monoallelically in human B cells. Aim. To study the role of nuclear organization in regulation of the IGH expression during B-cell differentiation. Methods. Immunofluorescence in situ hybridization on 3D-preserved nuclei (3D immuno-FISH). Results. Active RNA polymerase II (Pol II) molecules and the IGH locus were detected in the periphery of the nucleoli at some stages of B-cell differentiation. Conclusions. We observed significant changes in the pattern of distribution of RNA polymerase II in the nucleus during B-cell differentiation, but no preferential co-localization of the productive IGH allele with the transcription factories in the vicinity of the nucleolus and in the nucleoplasm was observed.; Лише один аллель гену важкого ланцюгу імуноглобуліну (IGH) експресується в В -клітинах людини. Мета. Вивчити роль ядерної організації у регуляції експресії IGH при диференціюванні В-клітин. Методи. Імунофлуоресцентна гібридизація in situ (3D immuno-FISH). Результати. Активна форма РНК-полімерази II (Pol II) і ген IGH були виявлені на периферії ядерець на деяких стадіях диференціювання В-клітин. Висновки. Ми спостерігали значні зміни в характері розподілу РНК-полімерази II в ядрі під час диференціювання В-клітин. При цьому, не спостерігалося мажорної локалізації продуктивного алелі IGH з транскрипційними фабриками ні у безпосередній близькості від ядерець, ні в нуклеоплазмі.; Лишь один аллель гена тяжелой цепи иммуноглобулина (IGH) экспрессируется в Б-клетках человека. Цель. Изучить роль ядерной организации в регуляции экспрессии IGH в процессе дифференцировки В-клеток. Методы. Иммунофлуоресцентная гибридизация in situ (3D immuno-FISH). Результаты. Активная форма РНК-полимеразы II (Pol II) и ген IGH были обнаружены на периферии ядрышек на некоторых стадиях дифференцировки В-клеток. Выводы. Мы наблюдали значительные изменения в характере распределения РНК-полимеразы II в ядре во время дифференцировки В-клеток. При этом, не наблюдалось премущественной локализации продуктивного аллеля IGH с транскрипционными фабриками ни в непосредственной близости от ядрышек, ни в нуклеоплазме. Fri, 01 Jan 2016 00:00:00 GMT http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/152827 2016-01-01T00:00:00Z http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/152826 Functional complementation of a conserved non protein-coding element (CNE) of Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus by heterologous CNE originating from Malacosoma neustria nucleopolyhedrovirus Kikhno, I.M.; Makarenko, V.E.; Kashuba, V.I. Aim. To assess the functional conservation of a baculovirus CNE. Methods. CNE deletion from the baculovirus genome and its replacement with a heterologous CNE was performed by using the bacmid-based technology. Transfection-infection assays were used to investigate cell-to-cell spread of the recombinant virus. Results. The recombinant Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus genome carrying the Malacosoma neustria nuclepolyhedrovirus CNE in place of the innate CNE was constructed. The recombinant virus was able to transmit the infection in a cell culture. Conclusions . The CNE essential function was foundto be conserved between the representatives of I and II groups of the genus Alphabaculovirus.; Мета. Оцінити функціональну консервативність бакуловірусного CNE (conserved non protein-coding element). Вивчити функціональне заміщення консервативного некодуючого елемента (CNE) вірусу ядерного поліедроза Autographa californica на СNE вірусу ядерного поліедрозу Malacosoma neustria. Методи. Видалення CNE з вірусного генома і його заміщення гетерологічним CNE було виконано з використанням бакмідной технології. Трансфекційно-інфекційний аналіз був застосований для дослідження поширення рекомбінантного вірусу від клітини до клітини. Результати. Було сконструйовано рекомбінантний геном віруса ядерного поліедрозу Autographa californica, що несе в своєму складі CNE віруса ядерного поліедрозу Malacosoma neustria замість власного CNE. Показано, що рекомбінантний вірус здатний передавати інфекцію в культурі клітин. Висновки. Абсолютно обов’язкова функкція CNE є консервативною для представників I і II груп роду Alphabaculovirus.; Цель. Оценить функциональную консервативность бакуловирусного CNE (conserved non protein-coding element). Методы. Удаление CNE из вирусного генома и его замещение гетерологичным CNE было выполнено с использованием бакмидной технологии. Трансфекционно-инфекционный анализ был применен для изучения распространения рекомбинантного вируса от клетки к клетке. Результаты. Был сконструирован рекомбинантный геном вируса ядерного полиэдроза Autographa californica, несущий в своем составе CNE вируса ядерного полиэдроза Malacosoma neustria вместо собственного CNE. Было показано, что рекомбинантный вирус способен передавать инфекцию в культуре клеток. Выводы. Абсолютно обязательная функция CNE является консервативной для представителей I и II групп рода Alphabaculovirus. Fri, 01 Jan 2016 00:00:00 GMT http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/152826 2016-01-01T00:00:00Z http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/152825 Evaluation of the RYR1 gene genetic diversity in the Latvian White pig breed Dokāne, K.; Jonkus, D.; Sjakste, T. The ryanodine receptor 1 (RYR1) is a calcium ion channel in the sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle. Multiple polymorphic loci have been identified in the RYR1 gene in human and animals and some of them are associated with certain phenotypes. However, there are still few data on the RYR1 genetic variability in pig and only the missense mutation Arg615Cys, associated with the malignant hyperthermia, porcine stress syndrome and meat quality, has been studied in several commercial and local breeds. Aim. To genotype the rs344435545 (C1972T, Arg615Cys), rs196953058 (T8434C, Phe2769Leu) and rs323041392 (G12484A, Asp4119Asn) in the Latvian local pig breed Latvian White and to evaluate the eventual functionality of amino acid substitutions. Methods. Loci were genotyped by the restriction fragment length polymorphism technology in the collection of 8 samples of original Latvian White collected in 2006 and 103 samples of Latvian White collected in three Latvian geographically distant private farms in 2015. SIFT online tool was applied to evaluate a potential effect of the amino acid substitutions on protein functions. Results. The loci rs344435545 and rs196953058 were found to be monomorphic in both collections. On the contrary, the rs323041392 showed a high level of polymorphism in the original Latvian White with GG/GA/AA genotype correlation equal to 3/4/1 and the absence of polymorphism in 2015 collection. From the studied loci, only the rs344435545 was identified as possessing the potential to change functions of the protein. Conclusions. The unfavourable rs344435545 T allele having functional effect on the protein function, appears not to have been introduced in the Latvian White pig breed. A compete loss of the rs323041392 variability in Latvian White happened in nine years of private farming;this could be a message to Latvian and other European livestock industry that the breeding intensification may decrease the genetic diversity, specific features performance and adaptability to the environmental challenges in local breeds of small populations.; Рецептор ріанодину 1 (RYR1) є кальцієвим іонним каналом саркоплазматичного ретикулуму скелетних м'язів. У гені RYR1 людини і тварин були виявлені кілька поліморфних локусів, деякі них пов'язані з певними фенотипами. Однак даних про генетичну мінливість RYR1 у свиней мало: для декількох комерційних і місцевих порід показана міссенс мутація Arg615Cys, пов'язана зі злоякісною гіпертермією, синдром свинячого стресу і якістю м'яса. Мета . Оцінити можливу функціональність амінокислотних замін у генотипах rs344435545 (C1972T, Arg615Cys), rs196953058 (T8434C, Phe2769Leu) і rs323041392 (G12484A, Asp4119Asn) місцевої латвійської білої породи свиней. Методи . Локус поліморфізму генотипували рестрикційними аналізом довжини фрагментів. Проаналізовано 8 зразків оригінальної латвійської білої породи свиней, зібрані в 2006 році і 103 зразків латвійської білої, відібрані в трьох латвійських географічно віддалених фермерських господарствах у 2015 році. Для оцінки потенційного ефекту амінокислотних замін на функції білка застосований онлайн-інструмент SIFT. Результати . Локуси rs344435545 і rs196953058 мономорфні в обох колекціях. При цьому rs323041392 показав високий рівень поліморфізму в оригінальній латиської білій породі з GG / GA / AA генотипом і кореляцією – 3/4/1 і відсутність поліморфізму в колекції 2015 році. З вивчених локусів, тільки rs344435545 має потенціал зміни функції білка. Висновки . Несприятливий на функцію білка аллель Т в rs344435545, не присутній в латвійській білій породі свиней. За дев'ять років у фермерських господарствах у латвійській білій породі свиней сталася втрата мінливості rs323041392. Латиській і європейської тваринницькій галузі необхідно врахувати, що інтенсифікація розмноження може знизити генетичну різноманітність, конкретні робочі характеристики і адаптивність до екологічних проблем у місцевих порід у невеликих популяціях.; Рецептор рианодина 1 (RYR1) является кальциевым ионным каналом саркоплазматического ретикулума скелетных мышц. В гене RYR1 человека и животных были обнаружены несколько полиморфных локусов, некоторые из которых связаны с определенными фенотипами. Однако данных о генетической изменчивости RYR1 у свиней мало: миссенс мутация Arg615Cys, связанная с злокачественной гипертермией, синдром свиного стресса и качеством мяса показана для нескольких коммерческих и местных пород. Цель. Оценить возможную функциональность аминокислотных замен в генотипах rs344435545 (C1972T, Arg615Cys), rs196953058 (T8434C, Phe2769Leu) и rs323041392 (G12484A, Asp4119Asn) местной латвийской белой породы свиней. Методы. Локус полиморфизма генотипировали рестрикционным анализом длины фрагментов. Проанализированы 8 образцов оригинальной латвийской белой породы свиней, собранные в 2006 году и 103 образцов латвийской белой, отобранные в трех латвийских географически удаленных фермерских хозяйствах в 2015 году. Для оценки потенциального эффекта аминокислотных замен на функции белка применен онлайн-инструмент SIFT. Результаты. Локусы rs344435545 и rs196953058 мономорфны в обоих коллекциях. При этом rs323041392 показал высокий уровень полиморфизма в оригинальной латышской белой с GG / GA / AA генотипом корреляции, равном 3/4/1 и отсутствие полиморфизма в коллекции 2015 году. Из изученных локусов, только rs344435545 обладает потенциалом изменения функции белка. Выводы. Имеющая влияние на функцию белка неблагоприятный аллель Т в rs344435545, не присутствует в латвийской белой породе свиней. За девять лет в фермерских хозяйствах у латвийской белой породы свиней произошла потеря изменчивости rs323041392. Как латышской так и европейской животноводческой отрасли необходимо учесть, что интенсификация размножения может снизить генетическое разнообразие, конкретные рабочие характеристики и адаптивность к экологическим проблемам у местных пород в небольших популяций. Fri, 01 Jan 2016 00:00:00 GMT http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/152825 2016-01-01T00:00:00Z