http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/151246 Sat, 18 Apr 2026 12:14:48 GMT 2026-04-18T12:14:48Z http://dspace.nbuv.gov.ua:80/bitstream/id/449909/ http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/151246 http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/152451 Cloning, expression and purification of D-Tyr-tRNATyr-deacylase from Thermus thermophilus Rybak, M.Yu.; Kovalenko, O.P.; Kryklyvyi, I.A.; Tukalo, M.A. D-Tyr-tRNATyr-deacylase (DTD) is a conservative enzyme, found in all domains of life, which ensures an additional checkpoint in the recycling of misaminoacylated D-Tyr-tRNATyr. DTD is capable of accelerating the hydrolysis of the ester linkage of D-Tyr-tRNATyr producing a free tRNA and D-tyrosine, thereby preventing an incorrect incorporation of D-amino acids into proteins. Deacylase distinguishes between D- and L-aminoacyl moieties and does not hydrolyze L-aminoacylated tRNA. The structural bases of this specificity and the mechanism of D-aminoacyl-tRNA hydrolysis are poorly understood. Aim. To clone D-Tyr-tRNATyr-deacylase from T. thermophilus (DTDTT), optimize the conditions for its expression in E.coli and develop an efficient purification procedure yielding the high quality enzyme suitable for the structural and functional studies. Methods. For amplification of DTD gene from T. thermophilus genomic DNA and its cloning into the pProEXHTb expression vector modern techniques were applied. Purification of the recombinant DTD protein was done with three types of column chromatography. His-tag was cleaved out from DTD by TEV protease. The cleavage was confirmed by Western blot analysis with anti-His-tag antibodies. Molecular weight of purified DTDTT was determined by the gel-filtration. Results. The expression construct pProEXHTb, containing DTD sequence from T. thermophilus, was obtained and successfully expressed in the BL21(DE3)pLysS E.coli strain. The protein of interest was purified to homogeneity by the combination of affinity (Ni-NTA), anion-exchange (Q-Sepharose) and size-exclusion (Superdex S 200) chromatographies. 2 mg of more than 90% pure recombinant DTD can be obtained from 1 L of bacterial culture. Molecular weight of purified DTD from T. thermophilus was determined to be 32 kDa, suggesting its dimeric structure. Conclusions. The pProEXHTb expression vector can be used for expression of DTD from T. thermophilus. The preparative amounts of DTD can be obtained after the three-step chromatographic procedures and used for further functional and structural studies.; D-Тир-тРНКТир-деацилаза (DTD) є консервативним білком, знайденим у всіх царствах живої природи, що забезпечує додатковий корегувальний етап гідролізу помилково аміноацильованих субстратів D-Тир-тРНКТир DTD здатна приcкорювати гідроліз ефірного зв’язку в комплексі D-Тир-тРНКТир, утворюючи вільну тРНК та D-Тир, таким чином попереджуючи включення D-амінокислот до білків. Деацилаза розрізняє D- та L-аміноацильні залишки в аміноацильованій тРНК та не гідролізує останні. Структурні основи такої специфічності та механізм гідролізу D-аміноацил-тРНК за участі DTD є недостатньо зрозумілими. Мета. Клонувати D-Тир-тРНКТир-деацилазу з T. the­rmophilus (DTDTT), оптимізувати умов її експресії в E. coli, розробити ефективний метод очищення з високим виходом високоякісного ферменту, для структурних та функціональних досліджень. Методи. Ампліфікацію та клонування в pProEXHTb DTD гена геномної ДНК T. ther­mo­philus проведено за стандартними молекулярно-біологічними методами. Очистку рекомбінантного DTD білка проводено хроматографічно. Залишки гістидину відщеплено від DTD протеазою вірусу тютюну (TEV), ефективність реакції перевірено Вестерн-блот аналізом з анти-His-антитілами. Молекулярну масу очищеної DTDTT визначено гель-фільтрацією. Результати. Отримана конструкція pProEXHTb, що містить DTD послідовність з T. thermophilus, експресовано в E.coli штаму BL21(DE3)pLysS. Цільовий рекомбінантний білок виділено і очищено комбінацєю хроматографій: афінної (Ni-NTA), аніон-обмінної (Q-Sepharose) та гель-фільтрації (Superdex S 200) до чистоти 90%. Вихід рекомбінантної DTD склав 2 мг з одного літру культури. Визначена молекулярна маса очищеної DTD з T. thermophilus – 32 кДа свідчить на користь її димерної структури. Висновки. Отриманий вектор pProEXHTb, що містить DTD з T. thermophilus і підібрані умови очистки дозволяють отримати рекомбінантний DTD в кількостях достатніх для подальших структурно-функціональних досліджень.; D-Тир-тРНКТир-деацилаза (DTD) является консервативным белком, найденным во всех царствах живой природы, обеспечивающим дополнительный корректирующий этап гидролиза ошибочно аминоацилированных субстратов D-Тир-тРНКТир. DTD ускоряет гидролиз эфирной связи в комплексе D-Тир-тРНКТир, предупреждая, таким образом, ошибочное включение D-аминокислот в белки. Деацилаза различает D- и L-аминоацильные остатки в аминоацилированной тРНК и не гидролизирует последние. Структурные основы такой специфичности и механизм гидролиза D-аминоацил-тРНК при участии DTD являются недостаточно изученными. Цель. Клонировать D-Тир-тРНКТир-деацилазу из T. thermophilus (DTDTT), оптимизировать условия её экспрессии в E. coli и разработать эффективный, с высоким выходом высококачественного фермента, метод очистки. Методы. Для амплификации и клонирования в pProEXHTb гена DTD геномной ДНК T. thermophilus использованы стандартные молекулярно-биологические методы. Очистку рекомбинантного DTD белка проводили хроматографически. Остатки гистидина отщепили протеазой вируса табака (TEV), еффективность реакции проверили Вестерн-блот анализом с анти-His-антителами. Молекулярный вес очищенной DTDTT определили гель-фильтрацией. Результаты. Полученная конструкция pProEXHTb, содержащая DTD последовательность T. thermophilus, экспрессирована в клетках E. coli штамма BL21(DE3)pLysS. Последовательными хроматографиями: афинной (Ni-NTA), анион-обменной (Q-Sepharose) и гель-фильтрации (Superdex S 200) получен гомогенный белок с чистотой более 90 %. Разработанная методика позволяет получить до 2 мг целевого белка / 1 л культуры. Определенный молекулярный вес очищенной DTD из T. thermophilus – 32 кДа свидетельствует о ее димерной структуре. Выводы. Полученная конструкция pProEXHTb, содержаащя DTD последовательность T. thermophilus и подобранные условия очистки позволяют получить рекомбинантный DTD для дальнейших структурно-функциональных исследований. Thu, 01 Jan 2015 00:00:00 GMT http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/152451 2015-01-01T00:00:00Z http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/152450 Identification of nitric oxide in mitochondria of myometrium cell Danylovych, Yu.V.; Karakhim, S.A.; Kolomiets, O.V.; Danylovych, G.V.; Kosterin, S.O. Aim. To demonstrate the possibility of NO synthesis in intact myocytes of uterus. Methods. Confocal scanning microscopy method, NO-sensitive fluorescent probe DAF-FM, MitoTracker Orange CM-H2TMRos. Results. The basal production of NO in intact myocytes was shown using DAF-FM. Incubation of myocytes with NO donor – sodium nitroprusside (SNP) – led to an increase of the DAF-FM-T fluorescent signal. On the contrary, the addition of NO-synthase inhibitor – N-nitro-L-arginine (NA) – results in the reduction of fluorescent intensity. It was demonstrated colocalizition of specific probe for mitochondria MitoTracker Orange CM-H2TMRos and NO-sensitive dye DAF-FM. Conclusions. For the first time it has been demonstrated the presence of NO in smooth muscle cell mitochondria using laser confocal microscopy, NO-sensitive probe DAF-FM and specific marker of the functionally active mitochondria MitoTracker Orange CM-H2TMRos.; Мета. Продемонструвати можливість синтезу NO в інтактних міоцитах матки щурів. Методи. Конфокальна скануюча мікроскопії, NO-чутливий флуоресцентний зонд DAF-FM, MitoTracker Orange CM-H2TMRos. Результати. Показано базальну продукцію NO в інтактних міоцитах за допомогою флуоресцентного зонду DAF-FM. Внаслідок інкубації клітин з донором NO нітропрусидом натрію (SNP) спостерігалось зростання флуоресцентного сигналу DAF-FM-T. І навпаки, внесення інгібітора NO-синтази – N-нітро-L-аргініну (NA) – призводило до гасіння флуоресценції. Доведено колокалізацію флуоресцентного мітохондріального маркеру MitoTracker Orange CM-H2TMRos та NO-чутливого зонду DAF-FM. Висновки. Вперше показано наявність NO в гладеньком’язових клітинах матки, і зокрема в мітохондріях, із залученням методу лазерної конфокальної мікроскопії, NO-чутливого зонду DAF-FM та специфічного маркеру функціонально активних мітохондрій MitoTracker Orange CM-H2TMRos.; Цель. Продемонстрировать возможность синтеза NO в интактных миоцитах матки крыс. Методы. Конфокальная сканирующая микроскопии, NO-чувствительный флуоресцентный зонд DAF-FM, MitoTracker Orange CM-H2TMRos. Результаты. Показана базальная продукция NO в интактных миоцитах с использованием флуоресцентного зонда DAF-FM. Инкубация миоцитов с донором NO – нитропруссидом натрия (SNP) – приводила к повышению флуоресцентного сигнала DAF-FM-T. И наоборот, внесение ингибитора NO-синтазы – N-нитро-L-аргинина (NA) – снижало интенсивность флуоресценции. Показана колокализация флуорес­центного митохондриального маркера MitoTracker Orange CM-H2TMRos и NO-чувствительного зонда DAF-FM. Выводы. Впервые показано присутствие NO в гладкомышечных клетках матки, в частности митохондриях, с использованием метода лазерной конфокальной микроскопии, NO-чувствительного зонда DAF-FM и специфического маркера функционально активных митохондрий MitoTracker Orange CM-H2TMRos. Thu, 01 Jan 2015 00:00:00 GMT http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/152450 2015-01-01T00:00:00Z http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/152449 Lipoxygenase regulation in vivo and in vitro by lipid compounds Skaterna, T.D.; Kopich, V.M.; Kharitonenko, G.I.; Kharchenko, O.V. Lipoxygenases (LOs) are known as one of the enzymes of lipid peroxidation. The majority of LOs are soluble enzymes and have affinity to membranes. The enzyme translocation from a cytosol to a membrane surface is one of the stages of regulation of the amount of LO catalysis products in the cell. A sorption to the membrane surface is described for most LOs from plant and animal sources. This review presents the data about regulation of the LO activity by the lipid compounds – both natural and chemically modified. Lipids might regulate the LO activity through: protein-lipid interactions of C2 domain with the membrane, changes in the enzyme affinity, the LOs translocation, allosteric regulation, increase in the selectivity towards substrates. The regulatory effect of active compound on the enzyme activity depends on the lipophilicity of effectors. Considering the LO activity it is necessary to take into account the enzyme microenvironment and its influence on the range of the LO products.; Ліпоксигенази (ЛО) відомі як одні з ферментів перекисного окислення ліпідів. Більшість ЛО є розчинними ферментами та характеризуються аффіністю до мембран. Транслокація ферменту з цитозолю на мембранну поверхню одна з стадій регуляції рівня продуктів ліпоксигеназного каталізу у клітині. Сорбція на мембранну поверхню описана для більшості ЛОз з рослинних та тваринних джерел. Даний огляд представляє дані по регуляції ЛОз активності природніми та хімічно модифікованими речовинами ліпідної природи. Здат­ність ліпідів регулювати ЛО активність може здійснюватись через: білок-ліпідні взаємодії C2 домену з мембраною, зміну аффінності ферменту, транслокацію ЛОз, алостеричну регуляцію, збільшення селективності до субстрату. Регуляторний вплив активної сполуки на ферментативну активність залежить від рівня ліпофільності ефекторів. При поясненні ліпоксигеназного каталізу необхідно враховувати вплив мікрооточення ферменту на рівень ЛО.; Липоксигеназы (ЛО) известны как одни из ферментов перекисного окисления липидов. Большинство ЛО растворимые ферменты и характеризуются аффиностью к мембранам. Транслокация фермента из цитозоля на мембранную поверхность одна из стадий регуляции уровня продуктов липоксигеназного катализа в клетке. Сорбция на мембранную поверхность описана для большинства ЛОз из растительных и животных источников. Данный обзор представляет данные по регуляции ЛО активности природными и химически модифицированными соединениями липидной природы. Возможность липидов регулировать ЛО активность может осуществляться через: белок-липидные взаимодействия C2 домена с мембраной, изменение аффинности фермента, транслокацию ЛОз, аллостерическую регуляцию, селективность к типу субстрата. Регуляторное влияние активного соединения на ферментативную активность зависит от уровня липофильности еффекторов. При объяснении липоксигеназного катализа необходимо учитывать влияние микроокружения фермента на уровень ЛО продуктов. Thu, 01 Jan 2015 00:00:00 GMT http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/152449 2015-01-01T00:00:00Z http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/152448 Monitoring of transplanted human Mesenchymal Stem Cells from Wharton’s Jelly in xenogeneic systems in vivo Kovalchuk, M.V.; Shuvalova, N.S.; Pokholenko, I.O.; Dragulyan, M.V.; Gulko, T.P.; Deryabina, O.G.; Kordium, V.A. Mesenchymal stem cells (MSCs) are ideal candidates for cell-based therapy aimed at tissue repair and immunomodulation. Aim. to study the survival of transplanted human MSCs from umbilical cord Wharton’s Jelly (hWJ-MSCs) in the animal model of experimental osteoarthritis (OA) in rats after injecting cells into a knee joint and to explore the effect of collagen scaffold on the cell survival in vivo. Methods. MSC isolation and cultivation in vitro. Immunological phenotyping of propagated hWJ-MSCs was performed by flow cytometry. The retention of transplanted cells was studied by the PCR revealing of human specific sequences in genomic DNA extracted from animal tissues. Results. hWJ-MSCs, both individual and grown on scaffold, were used and it was shown by PCR that human alpha-satellite DNA was detected on the first day in the immunocompetent OA animals inside the injured knee joint. In the collagen matrix (in the model of subcutaneous implantation) human alpha-satellite DNA was detected on the 5th day but was not detected on the 12th day. Conclusions. According to the PCR results, hWJ-MSCs survived in the OA animal model for a short period. Collagenic scaffold increased the residence time of donor cells in the recipients. hWJ-MSCs may be considered as a perspective cell source for the treatment of OA in human.; Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) являются идеальными кандидатами для восстановление тканей и иммуномодуляции при клеточной терапии. Цель. Изучить выживание трансплантированных МСК Варто­но­во­го студня пуповины человека (МСК-ВС) на модели экспериментального остеоартроза у крыс (введение клеток в коленный сустав), и исследовать влияние коллагенового матрикса на выживание МСК-ВС in vivo. Методы. Вы­де­ление и культивирование МСК-ВС in vitro. Имму­но­ло­ги­ческое фенотипирование мультиплицированных МСК-ВС про­ведено с помощью проточной цитофлуорометрии. Сохра­не­ние трансплантированных клеток изучали с помощью ПЦР, выявляющей специфические для человека последовательности в геномной ДНК, изолированной из тканей животных. Результы. Исследование индивидуальних и выращенные на матриксе МСК-ВС, с помощью ПЦР, показало, что альфа-сателлитная ДНК человека детектировалась в первые сутки у иммунокомпетентных животных в поврежденном суставе. В коллагеновом матриксе (в модели подкожной имплантации) ДНК человека была обнаружена на 5, но не детектировалась на 12 сутки. Вы­воды. По результатам ПЦР МСК-ВС выживали у жи­вотных с остеоартритом в течение короткого периода. Коллагеновый матрикс увеличивал продолжительность пре­бывания МСК-ВС у реципиентов. МСК-ВС могут рассматриваться как перспективный источник клеток для лечения остеоартрита у человека.; Мезенхімальні стовбурові клітини (МСК) є ідеальними кандидатами для відновлення тканин та імуномодуляції при клітинній терапії. Мета. Вивчити виживання трансплантованих МСК Вартанового студню пуповини людини (МСК-ВС) на моделі експериментального остеоартрозу у щурів (введення клітин в колінний суглоб), та дослідити вплив коллагенового матриксу на виживання МСК-ВС in vivo. Ме­тоди. Виділення і культивування МСК-ВС in vitro. Імуно­ло­гічне фенотипування мультиплікованих МСК-ВС проведено за допомогою проточної цитофлуорометрії. Збере­жен­ня трансплантованих клітин вивчали за допомогою ПЛР, що виявляє специфічні для людини послідовності в геномній ДНК, ізольованій з тканин тварин. Результи. Використано індивідуальні та вирощені на матриксі МСК-ВС, ПЛР показано, що альфа-сателітна ДНК людини в пошкодженому суглобі у імунокомпетентних травмованих тварин виявлялась за добу. У колагеновому матриксі (в моделі підшкірної імплантації) ДНК людини була виявлена на 5, але не детектувалась на 12 добу. Висновки. За результатами ПЛР МСК-ВС виживали у тварин з остеоартрітом протягом нетривалого часу. Кола­ге­но­вий матрикс збільшував тривалість перебування МСК-ВС у реципієнтів. МСК-ВС можуть розглядатися як перспектив­не джерело клітин для лікування остеоартриту у людини. Thu, 01 Jan 2015 00:00:00 GMT http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/152448 2015-01-01T00:00:00Z