http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/38720 2026-04-23T12:41:46Z 2026-04-23T12:41:46Z Луцик, М. Навитка, С. Придатко, О. Стойка, Р. http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/74474 2015-01-21T01:02:44Z 2010-01-01T00:00:00Z

Фракціонування і властивості протеїназ клітин мишачої лімфоми NK/Ly Луцик, М.; Навитка, С.; Придатко, О.; Стойка, Р. Виявлено, що лізат клітин мишачої лімфоми NK/Ly містить протеїнази, активність яких за рівнем гідролізу казеїну при рН 5,4 становить 26,3 мкг казеїну за хвилину на мг білка, а при рН 8,0 - 15,0 мкг казеїну за хвилину на мг білка. Для очистки протеїназ і дослідження їх властивостей проведено фракціонування лізату клітин NK/Ly за допомогою ступеневого висолювання амонію сульфатом, диференційного осадження глобулінів за умов низької іонної сили і поступового зниження рН, хроматографії на колонці цібакрон-сефарози та афінної хроматографії на Т-гелі, а також шляхом імунопреципітації. Використання різних способів фракціонування дозволило досягти певного підвищення питомої протеолітичної активності препаратів, проте при цьому не вдалося одержати препарати протеїназ, які б були гомогенними за білковим складом. Результати електрофоретичного аналізу досліджуваних зразків протеїназ вказують на значну агрегацію білкових комплексів, до яких вони входять. Іншою особливістю протеїназ клітин лімфоми NK/Ly є нечутливість до інгібувальної дії йодацетаміду, α-2 макроглобуліну і трасилолу. Обговорено роль різних типів протеїназ при пухлинному рості. Ключові слова: пухлини, лімфома NK/Ly, протеїнази.; Proteolytic activity, purification and properties of proteinases from murine lymphoma NK/Ly ascitic cells were investigated. In cell lysates proteolytic activity as measured by hydrolysis of casein was on the level 26.3 ug of casein/min per mg of protein at pH 5,4 and 15.0 ug of casein /min per mg of protein at pH 8,0. By fractional precipitation with ammonium sulfate proteins of lysates were separated into three fractions – immunoglobulin-like, albumin and post-albumin. The highest specific proteolytic activity was detected in postalbumin fraction, but the yield of protein material was the lowest. Disc electrophoresis of obtained fractions in standard conditions at pH 8,9 revealed serum albumin as a predominant protein in albumin and post-albumin fractions. In all fractions the substantial quantity of protein did not enter the gel and was retained in start position, indicating on the presence of highly aggregated protein complexes. For elimination of blood plasma proteins from post-albumin fraction immunoprecipitation with antibodies towards mouse blood proteins was applied, providing three-fold increase in specific proteolytic activity. By chromatography on Cibacron blue sepharose it was revealed that proteinases were not retained on the sorbent and passed through the column resulting in three fold increase of proteolytic activity. Proteinases of immunoglobulin fraction were purified by fractional precipitation of globulins by stepwise lowering of pH at low ionic strength. This approach was however non effective as it did not provide an increase in proteolytic activity apparently due to damaging effect on enzymes. Detectable proteolytic activity was revealed in subcellular particles obtained from ascitic fluid by high speed centrifugation after elimination of cells. SDS PAGE revealed a numerous bands in each fraction, derived mainly from material not entering the gel in non denaturating electrophoresis. This indicates on association of proteinases with multimolecular complexes or subcellular particles. Purified proteinases obtained from NK/Ly cells were insensitive to commonly used inhibitors trasylol, iodoacetamide and α-2 macroglobulin. The role of different types of proteinases in metastasis and other harmful effects during tumor growth is discussed. Key words: tumors, lymphoma NK/Ly, proteinases.; Установлено, что в лизате клеток мышиной лимфомы NK/Ly содержатся протеиназы, активность которых по уровню гидролиза казеина при рН 5,4 составляет 26,3 мкг казеина в минуту на мг белка, а при рН 8,0 −15,0 мкг казеина в минуту на мг белка. Для очистки протеиназ и изучения их свойств проведено фракционирование белков лизата клеток NK/Ly с помощью ступенчатого высаливания сульфатом аммония, дифференцированного осаждения глобулинов в условиях низкой ионной силы и постепенного снижения рН, хроматографии на колонке с цибакрон-сефарозой и аффинной хроматографии на Т-геле, а также с помощью иммунопреципитации. Применение различных методов фракционирования позволило достичь определенного повышения удельной протеолитической активности препаратов, однако не при этом удалось получить препараты протеиназ, которые были бы гомогенны по белковому составу. Результаты электрофоретического анализа исследуемых образцов протеиназ указывают на значительную аггрегацию белковых комплексов, в которых они содержатся. Другой особенностью протеиназ клеток лимфомы NK/Ly является их нечувствительность к ингибиторному действию иодацетамида, α2-макроглобулина и трасилола. Обсуждена роль различных типов протеиназ в процесах опухолевого роста. Ключевые слова: опухоли, лимфома NK/Ly, протеиназы.

2010-01-01T00:00:00Z Цирульник, А. Снітинський, В. Стойка, Р. http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/74473 2015-01-21T01:02:42Z 2010-01-01T00:00:00Z

Синтез модифікованого гена транскрипційного фактора STAT5a Цирульник, А.; Снітинський, В.; Стойка, Р. Транскрипційні фактори родини STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription) є ключовими регуляторами експресії генів стимульованих цитокінами, що впливають на різні клітинні процеси. Транскрипційний фактор STAT5a опосередковує стимуляцію клітинного росту, проліферації та ангіогенезу. Сучасні дослідження біологічної ролі білків STAT проводять шляхом створення експериментальних моделей мишей, що містять у геномі штучно синтезовані та модифіковані форми генів відповідних транскрипційних факторів. Метою даної роботи був синтез модифікованого гена STAT5a. Введення цього гена у геном миші дозволяє моделювати процеси активації STAT5a in vivo та досліджувати його роль у забезпеченні патологічних змін в організмі. Ключові слова: синтез ДНК, транскрипційні фактори STAT, модифікація генів.; Cytokines are small secreted proteins which mediate cell growth, proliferation, survival and apoptosis. They are crucial regulators of immunity and hematopoiesis. Cytokines generally act at very low concentration and short time spans. The JAK-STAT signaling pathway is one of the most important mechanisms of cell response to the cytokines. Binding of cytokine to the specific membrane receptor on the cell activates the JAK (Janus Kinase) kinase which adds a phosphate group to the STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription) proteins. After posphorylation, STAT proteins form via their SH2 domain the active dimers. The dimers move into the cell nucleus via importin a/b and RanGDP complex and bind to DNA-recognition region called gamma activated sites (GAS) in the promoter region of cytokine inducible genes and activates transcription of these genes. Then, nuclear phosphatases dephosphorylate the STATs which leads to their inactivation and transportation from the nucleus by exportin crm1/RanGTP complex. There are seven members of STAT protein family: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a STAT5b and STAT6. STAT1 and STAT2 become activated in response to the interferons and can form the homodimers or heterodimers with other STATs. STAT3 is activated by interleukin 5, interleukin-6, hepatocyte growth factor, interferons, epidermal growth factor and leukemia inhibitory factor (LIF). STAT3 regulates cell growth and apoptosis. Since it has anti-apoptotic and proliferative effects, hyperactivation of this transcription factor is associated with various tumors, such as chronic lymphocytic leukemia, Burkitt's lymphoma, cutaneous T cell lymphoma, Hodgkin desease, malignant melanoma, lung cancer, prostate carcinoma and renal cell carcinoma. STAT4 and STAT6 become phosphorylated in response to interleukin-4 and interleukin-12, respectively. They are involved in regulation of immune response and lymphocyte activation. The transcription factor STAT5b is activated by interleukin 2, interleikin 4 and CSF1. It mediates apoptosis, TCR signaling and liver gene expression. Our studies we focused on STAT5a, since it plays a crutial role in basic cell functions, like cell growth, proliferation, angiogenesis and additionally, serves as powerful anti-apoptotic factor through activation of BCL2L1/BCL-X(L) expression in the cell. JAK kinase phosphorylates STAT5a in response to interleukin 2, interleukin 3, interleukin 7 GM-CSF, erythropoietin and thrombopoietin. The high level of activated STAT5a was found in erythroleukemia, acute lymphocytic leukemia, acute myelogenous leukemia, chronic myelogenous leukemia, megakaryocytic leukemia, sezary syndrome, anaplastic large T cell lymphoma, B cell lymphoma, head and neck cancer, cerebral menangiomas, neuroendocrine tumors, pancreatic carcinoma, ovarian carcinoma and colon cancer. Detection of hyperactivated STAT5a protein serves as one of the diagnotic markers of these tumors. Investigation of the role of STAT5a in tumor development is a very perspective direction of biology and medicine since it can help in designing a new effective diagnotic and therapeutic approaches. Modern investigations of the biological role of STATs in tumor formation are mainly performed by generation of transgenic animal models with modified genes of appropriate transcription factor. The main goal of this work was to synthesize modified STAT5a gene. We used classic methods for DNA synthesis and purification including polymerase chain reaction, site direct mutagenesis and electrophoresis in agarose gele. The cloning was performed with using various endonucleases and T4-ligase. All steps of DNA synthesis and cloning were analyzed by DNA sequencing. We also tested functional activity of modified STAT5a by transformation of NIH 3T3 cells. Our data confirmed synthesis of the modified STAT5a gene. The protein of this gene is expressed at high level and possesses a specific DNA binding activity. Introduction of modified gene of STAT5a into mouse genome allows to modulate the process of STAT5a hyperactivation in vivo and to investigate the role of this transcription factor in the mechanisms of tumor development. Key words: DNA syntesis, STAT transcription factors, gene modification; Транскрипционные факторы семейства STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription) являются ключевыми регуляторами експрессии генов, стимулированных цитокинами, влияющими на разные клеточные процессы. Транскрипционный фактор STAT5a способствует стимуляции клеточного роста, пролиферации и ангиогенезу. Современные исследования биологической роли белков STAT проводят с использованием експериментальных мышиных моделей, имеющих в составе своего генома искусственно синтезированные и модифицированные гены транскрипционных факторов. Целью данной работы был синтез модифицированного гена STAT5a. Введение этого гена в геном мыши позволит моделировать процесс активации STAT5a in vivo и проводить исследование его роли в процессах развития патологических процессов в организме. Ключевые слова: синтез ДНК, транскрипционные факторы STAT, модификация генов.

2010-01-01T00:00:00Z Фальфушинська, Г. Гнатишина, Л. Шимків, Т. Столяр, О. http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/74472 2015-01-21T01:02:40Z 2010-01-01T00:00:00Z

Реакційна здатність металотіонеїнів та ефективність їх метал-депонуючої та антиоксидантної функцій у адаптації риби Carassius carassius до природного забруднення Фальфушинська, Г.; Гнатишина, Л.; Шимків, Т.; Столяр, О. Металотіонеїни (МТ) є стресорними білками з метал-депонуючою та антиоксидантною функціями, співвідношення між якими у тварин в природних умовах існу- вання не з’ясоване. Для визначення ефективності цих функцій у риб за умов комплексного забруднення середовища визначали хроматографічну поведінку та концентрацію МТ за вмістом металів (Ме-МТ) та тіолів (SH-МТ) в печінці та зябрах карася (Carassius carassius) з двох місцевостей весною, влітку та восени. Вимірювали також концентрацію глутатіону (GSH), супероксид-аніону (O2 • ) та карбонільних похідних білків (КПБ). Згідно факторного і кореляційного аналізів сезонна залежність показників риб домінувала в печінці, а просторова була більше виражена у зябрах. Восени спостерігали збільшення об’єму ізоформи MT-2/2a та частки міді у складі металів МТ. При порівнянні реакційної здатності SH-груп реконструйованих α- та β-доменів МТ карася встановлено, що вона вища у Cu-β-домену. Тому високий вміст тіолів SH-МТ та GSH у поєднанні з малими значеннями вмісту O2 • , КПБ та Ме-МТ у карася із забрудненої водойми восени, особливо в зябрах, трактуємо як свідчення ослаблення метал-депонуючої здатності МТ на користь антиоксидантної функції Cu-МТ. Мікроядерний тест підтвердив відсутність токсичного ефекту на риб у забрудненій місцевості. Ключові слова: Carassius carassius, металотіонеїни, антиоксидантний захист, природне забруднення.; Crucian carp Carassius carassius is a hardy fish, which is widely distributed in fresh waters and whose feeding habits expose it to many different types of environmental contaminants. It is known to be especially well equipped for metabolic depression, and the gills plays an important role in this tolerance. It is the only adult vertebrate known to have this ability. However, the molecular stress-related processes in the tissues of crucian carp are studied scant and mainly under the effect of separate toxic substances in the laboratorial studies. Metallothioneins (MTs) are stress-proteins with metal-keeping and antioxidant functions, which parity in animals from field conditions is unclear. Since the synthesis of MTs is often induced when organisms are exposed to heavy metals, especially Cd, MTs are proposed to be a specific “biomarker” responsive to metal pollution in aquatic animals, including fish. The aim of this study was to appreciate the variability of responses of MTs in the crucian carp from mixed polluted environment. For that, the chromatographic behaviour and MTs concentration were determined as their metal (Me-MT) and thiol (SH-MT) contents in the liver and gills of fish from two sites in spring, summer and autumn. Sites near the springs of the river (comparatively clean) and downstream of the river (polluted) were selected. To elucidate the contribution of the temporal and spatial factors in the variability of the responses of antioxidative defence system, the glutathione (GSH), superoxide-anion (O2• ) and protein carbonyls (PC) concentrations were determined. The Gel-filtration of the thermostable solutions from both liver and gills of crucian carp on Sephadex G-75 revealed peak identified as MT-containing peak based upon its spectral features, thermostability, and low molecular weight, apparently of 7 – 8 kDa. The anion-exchange liquid chromatography on DEAE cellulose of the thermostable solution demonstrated two chromatographic forms, constant MT-1 (0,24 М NaCl) and variable MT-2/2a (0,39 М NaCl/0,32 М NaCl). The content of metals in the composition of MTs ranged at 7 – 25 nmol/g of tissue for the copper, 80 –120 nmol/g of tissue for the zinc, and 1 – 12 nmol/g of tissue for the cadmium. Especially significant differences of the content of separate metals and general content of Ме-МТ between the two groups were shown in the gills. These differences were opposite in spring and autumn. The elevation of the value of MT-2/2a form in autumn and the increase of the part of the copper compare to the zinc in the metal composition of MTs from spring to autumn was detected. It was particularly prominent in MT-2/2a and in the fish from polluted site. The separate domains of the MTs of crucian carp were isolated. Incubation of Cd-enriched MTs with EDTA and subtilisin produced α-domain, whilst the preferential binding of Cu(I) to the β domain of the apothionein and the tolerance toward proteolysis of the Cu(I) bound domain permit the isolation of β-domain. In order to characterize the reactivity of the cysteinyl groups in separate domains, we studied their reactions with 5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) (Ellman’s reagent). By the comparison of the reactivity of SH-groups in rebuilded α- and β-domains of MTs, higher reactivity of Cu-β-domain was established. According to Principal Component and correlative analyses, seasonal dependence of studied indices predominated in the liver, and spatial dependence was better revealed in the gills. Micronuclear test showed comparatively low level of nuclear abnormalities in fish from both sites. Nevertheless, the high levels of thiols, SH-MT and GSH, jointly with low O2 • , PC and Me-MT levels were shown in the tissues of fish from polluted site in autumn, especially in gills. The integrated index of antioxidant-prooxidant state was calculated. It showed significantly higher antioxidative potential in the tissues of fish from polluted site compare to counterpart in autumn, especially in the gills. Based on the peculiarities of MTs and their separated domains features, high level of antioxidative defence in the fish from polluted site was explained as the benefit of antioxidant function of Cu-MT combined with the manifestation of the weakening of the metal-binding function, particularly toward Zn. Key words: Carassius carassius, metallothionein, antioxidative defense, field pollution.; Металлотионеины (МТ) – это стрессорными белки с металл-депонирующей и антиоксидантной функциями, соотношение которых у животных из естественных водоемов нe изучалось. Для оценки эффективности этих функций у рыб в условиях комплексного загрязнения среды определяли хроматографическое поведение и уровень МТ по содержанию в них металлов (Me-MT) и тиоловых групп (SHMT) в печени и жабрах карася (Carassius сarassius) из двух местностей весной, летом и осенью. Также определяли уровень глутатиона (GSH), супероксид-аниона (O2 • ) и карбонильных производных белков (КПБ). Согласно результатов факторного и корреляционного анализов, в печени преобладала сезонная зависимость показателей, а в жабрах более проявлялась зависимость от местности. Осенью наблюдали увеличение объема изоформы MT-2/2a и доли меди в составе металлов МТ. Сравнение реакционной способности SH-групп реконструированных α- и β-доменов МТ показало что Сu-β-домен обладает более высокой реакционной способностью. Таким образом, высокое содержание тиолов SH-MT и GSH согласованно с низким уровнем O2 • , КПБ и Me-МТ в тканях карася из загрязненной местности, особенно в жабрах, объясняем как признак ослабления металл- депонирующей функции МТ в пользу антиоксидантной функции Cu-МТ. Результаты микроядерного теста подтвердили отсутствие токсического воздействия на рыбу в загрязненной местности. Ключевые слова: Carassius carassius, металлотионеины, антиоксидантная защита, естественное загрязнение.

2010-01-01T00:00:00Z Базиляк, Л. Дутка, В. http://dspace.nbuv.gov.ua:80/handle/123456789/74471 2015-01-21T01:02:37Z 2010-01-01T00:00:00Z

До 85-и річчя з дня народження Романа Кучера Базиляк, Л.; Дутка, В.

2010-01-01T00:00:00Z