Вiopolymers and Cell, 2010, №. 2

Наслідки РНК-інтерференції генів убіквітину та протеасомної субодиниці β7 у культивованих кардіоміоцитах

2019-07-06T17:29:30Z

Наслідки РНК-інтерференції генів убіквітину та протеасомної субодиниці β7 у культивованих кардіоміоцитах Кириченко, В.О.; Нагібін, В.С.; Тумановська, Л.В.; Рибальченко, В.К.; Досенко, В.Є.; Мойбенко, О.О. Зважаючи на значну роль убіквітин-залежного протеасомного протеолізу (УПП) у регуляції кількості білків, що контролюють запрограмовану клітинну смерть (апоптоз та аутофагію), метою роботи було дослідження здатності кардіоміоцитів до виживання при специфічному приглушенні генів убіквітину (UBB) та ключової для збірки протеасоми субодиниці 7 (PSMB7). Методи. Застосовано методи РНК-інтерференції (для приглушення генів UBB і PSMB7), флуоресцентної мікроскопії та полімеразної ланцюговї реакції у реальному часі. Результати. Показано, що приглушення генів UBB і PSMB7 знижує їхню експресію в 2,4 (р < 0,05) та 1,6 разу (р > 0,05) відповідно, при цьому зростає кількість некротичних клітин без зміни рівня апоптичних. Кількість клітин з ознаками аутофагії значно збільшується за рахунок порушення УПП і накопичення великої кількості внутрішньоклітинних білків, які деградують внаслідок лізису. Висновки. Отримані дані свідчать про те, що приглушення генів UBB і PSMB7 індукує загибель кардіоміоцитів через некроз та аутофагію, не впливаючи на кількість апоптичних клітин.; Aim. Ubiquitin (UBB) and proteasome 7 subunit (PSMB7) genes silencing is interesting due to the crucial role of ubiquitin-dependent proteasomal system (UPS) in turnover of functional proteins, which controls program cell death (apoptosis, auophagy). Methods. We used methods of RNA interference (for UBB and PSMB7 genes silencing), fluorescence microscopy and real-time PCR. Results. It was shown that small interference RNA injection in cell culture decreased ubiquitin expression in 2,4 (P < < 0.05), PSMB7 – in 1,6 times (P > 0.05). At the same time, there was augmented level of necrotic cells with no change in number of apoptotic cells. Cells with signs of autophagy were much augmented as consequence of UPS impairment and intracellular proteins accumulation, which degrade in lysosomes. Conclusions. The data obtained testify that UBB and PSMB7 genes silencing induces cell necrosis and autophagy without changing number of apoptotic cells.; Учитывая значительную роль убиквитин-зависимого протеасомного протеолиза (УПП) в регуляции белков, контролирующих запрограммированную клеточную гибель (апоптоз, аутофагия), цель работы состояла в исследовании способности кардиомиоцитов к выживанию при специфическом заглушении генов убиквитина (UBB) и протеасомной субъединицы 7 (PSMB7), отвечающей за сборку 26S протеасомы. Методы. Применены методы РНК-интерференции (для заглушения генов UBB и PSMB7), флуоресцентной микроскопии и полимеразной цепной реакции в реальном времени. Результаты. Показано, что заглушение генов UBB и PSMB7 снижает их экспрессию в 2,4 (Р < 0,05) и 1,6 раза (Р > 0,05) соответственно, при этом увеличивается количество клеток, погибших вследствие некроза, без изменения уровня апоптических клеток. Содержание клеток с признаками аутофагии значительно возрастает из-за нарушения функционирования УПП и накоп- ления большого количества внутриклеточных белков, деградирующих в результате лизиса. Выводы. Полученные данные свидетельствуют о том, что заглушение генов UBB и PSMB7 индуцирует некротическую и аутофагическую гибель кардиомиоцитов, не влияя на количество апоптических клеток.

Oxidative stress, advanced glycation end products and residual renal function in the rat model of unilateral ureteral obstruction: effects of phlogenzym and losartan

2019-07-06T17:26:37Z

Oxidative stress, advanced glycation end products and residual renal function in the rat model of unilateral ureteral obstruction: effects of phlogenzym and losartan Sebekova, K.Jr.; Blazicek, Jr.P.; Syrova, D.; Galbavy, S.; Schinzel, R.; Heidland, A.; Sebekova, K. Aim. Oxidative stress plays a role in the pathogenesis of ureteral obstruction. Methods. We studied parameters of oxidative status, levels of advanced glycation end products (AGEs), and contralateral (CL) kidney function in the rat model of unilateral ureteral obstruction (UUO). The effect of Phlogenzym (12 mg/day orally); losartan (20 mg/l in drinking water), and their combination was studied. Results. In placebo-administered UUO rats AGEs and malondialdehyde levels were higher than in the sham operated controls. Function of the CL kidney was slightly impaired, its collagen content and protein/deoxyribonucleic acid ratio (P/DNA) in the glomeruli increased. All treatments prevented the rise in collagen content, P/DNA ratio, and improved CL kidney function. Phlogenzym ameliorated lipid peroxidation and AGE levels. Conclusions. In the model of UUO systemically increased oxidative stress may play a role in development of tubulointerstitial fibrosis and in the functional impairment of the CL kidney. Suppression of the oxidative stress and blockade of angiotensin-1 receptors might mitigate the progression of obstructive uropathy.; Оксидативний стрес відіграє значну роль у патогенезі обструкції сечоводу. Мета роботи полягала у вивченні параметрів оксидативного статусу, оцінюванні рівня кінцевих продуктів глікації і функціонування контралатеральної нирки на моделі щурів з унілатеральною обструкцією сечоводу (УОС). Методи. На моделі УОС досліджували ефекти флогензиму (12 мг в день орально) і лосартану (20 мг/л у питній воді), а також їхньої комбінації. Результати. У щурів з УОС, які отримували плацебо, рівень накопичення кінцевих продуктів глікації та малондіальдегіду виявився вищим, ніж у несправжньооперованих контрольних щурів. Функціонування контралатеральної нирки незначно погіршилося, концентрація колагену і співвідношення вмісту білок/дезоксирибонуклеїнова кислота (P/ DNA) у клубочку нирки підвищені. Обробка досліджуваними лікарськими засобами запобігала збільшенню вмісту колагену, зростанню показника співвідношення P/DNA та покращувала функціонування колатеральної нирки. Флогензим сприяв підвищенню рівня перекисного окиснення ліпідів та кінцевих продуктів глікації. Висновки. У моделі УОС систематичне збільшення оксидативного стресу може відігравати важливу роль у розвитку тубулоінтерстиційного фіброзу і порушенні функціонування контралатеральної нирки. Супресія оксидативного стресу та блокування рецептора ангіотензину-1 можуть послаблювати прогресію обструктивної уропатії.; Оксидативный стресс играет значительную роль в патогенезе обструкции мочеточника. Цель работы состояла в изучении параметров оксидативного статуса, оценке уровня конечных продуктов гликации и функционирования контралатеральной почки на модели крыс с унилатеральной обструкцией мочеточника (УОМ). Методи. На модели УОМ исследовали эффекты флогензима (12 мг в день орально) и лосартана (20 мг/л в питьевой воде), а также их комбинации. Результаты. У крыс с УОМ, получавших плацебо, уровень конечных продуктов гликации и малондиальдегида оказался выше, чем у ложноооперованных контрольных крыс. Функционирование контралатеральной почки незначительно ухудшилось, концентрация коллагена и соотношение содержания белок/дезоксирибонуклеиновая кислота (P/DNA) в клубочке почки повысились. Обработка исследуемыми лекарственными средставами предотвращала увеличение содержания коллагена, показателя соотношения P/DNA и улучшала функционирование колатеральной почки. Флогензим способствовал возрастанию уровня перекисного окисления липидов и конечных продуктов гликации. Выводы. В модели УОМ систематическое увеличение оксидативного стресса может быть причиной развития тубулоинтерстиционного фиброза и нарушения функционирования контралатеральной почки. Супрессия оксидативного стресса и блокирование рецептора ангиотензина-1 можгут ослаблять прогрессию обструктивной уропатии.

New technique of identifying the hierarchy of dynamic domains in proteins using a method of molecular dynamics simulations

2019-07-06T17:28:49Z

New technique of identifying the hierarchy of dynamic domains in proteins using a method of molecular dynamics simulations Yesylevskyy, S.O. Despite a large number of existing domain identification techniques there is no universally accepted method, which identifies the hierarchy of dynamic domains using the data of molecular dynamics (MD) simulations. The aim of this work is to develop such technique. Methods. The dynamic domains are identified by eliminating systematic motions from MD trajectories recursively in a model-free manner. Results. The technique called the Hierarchical Domain-Wise Alignment (HDWA) to identify hierarchically organized dynamic domains in proteins using the MD trajectories has been developed. Conclusion. A new method of domain identification in proteins is proposed.; Незважаючи на велику кількість існуючих підходів до ідентифікації доменів у білках, на сьогодні немає єдиного загальновизнаного методу, який міг би визначати ієрархію динамічних доменів на основі даних молекулярної динаміки. Метою роботи є створення такого методу. Методи. Домени визначають рекурсивним елімінуванням систематичних рухів у траєкторіях молекулярної динаміки. Результати. Розроблено новий метод визначення ієрархії доменів на основі даних молекулярної динаміки, який отримав назву ієрархічного доменного вирівнювання (HDWA).; Несмотря на большое количесто существующих подходов к определению доменов в белках, на сегодня нет единого общепризнанного метода, с помощью которого можно было бы идентифицировать иерархию динамических доменов на основе данных молекулярной динамики. Целью работы является разработка такого метода. Методы. Домены определяют рекурсивным элиминированием систематических движений в траекториях молекулярной динамики. Результаты. Создан новый метод определения иерархии доменов на основе данных молекулярной динамики, получивший название иерархического доменного выравнивания (HDWA).

Identification and functional analysis of an alternative promoter of human intersectin 1 gene

2019-07-06T17:26:08Z

Identification and functional analysis of an alternative promoter of human intersectin 1 gene Kropyvko, S.V.; Tsyba, L.O.; Skrypkina, I.Ya.; Rynditch, A.V. Intersectin 1 (ITSN1) gene encodes an evolutionarily conserved adaptor protein that functions in clathrin-mediated endocytosis, cell signalling, apoptosis and cytoskeleton rearrangements. Its expression is characterized by multiple alternative splicing. Alternative promoter usage is an additional way to create diversity and flexibility in the regulation of gene expression. The aim of this study was to identify possible alternative promoters of ITSN1 gene. Methods. In silico prediction, 5' RACE, RT-PCR and reporter gene expression assay were used for identification and functional characterization of alternative promoter region. Results. We detected an alternative promoter of human ITSN1 gene which is located in intron 5 and generates 5' truncated transcripts containing in-frame ATG codon with strong Kozak sequence and could encode an N-terminally truncated isoforms lacking first EH domain. The region located 246–190 bp upstream of exon 6 is required for alternative promoter activity. ITSN1 transcripts generated from an alternative promoter were detected in human kidney, liver, lung and brain tissues. However, the level of their expression was significantly lower than that of major ITSN1 isoforms. Conclusion. The results obtained suggest that alternative promoter region located in intron 5 of ITSN1 gene functions as a weak promoter. Further experiments are required to clarify the role of 5' truncated ITSN1 transcripts.; Ген інтерсектину 1 (ITSN1) кодує еволюційно консервативний адаптерний білок, причетний до клатрин-опосередкованого ендоцитозу, внутрішньоклітинної передачі сигналу, апоптозу та реорганізації цитоскелету. Його експресія пов‘язана з багатьмя подіями альтернативного сплайсингу. Додатковим способом досягнення різноманіття і тонкої регуляції експресії генів є пошук альтернативних промоторів. Мета роботи полягала у виявленні можливих альтернативних промоторів гена ITSN1. Методи. Застосоваано комп’ютерне передбачення, 5' RACE, RT-РCR і тест, оснований на аналізі експресії репортерного гена. Результати. Виявлено альтернативний промотор гена ITSN1 людини, локалізований у 5-му інтроні, внаслідок використання якого утворюються транскрипти з відкритою рамкою зчитування та консенсусною послідовністю Козак, здатні кодувати ITSN1-ізоформи без першого EH-домену. Визначено, що ділянка, розташована за 246–190 п. н. до початку 6-го екзона, необхідна для функціонування альтернативного промотору. Транскрипти ITSN1, що утворюються в результаті використання альтернативного промотору, знайдено в тканинах нирок, печінки, легень і мозку людини, проте рівень їхньої експресії значно нижчий порівняно з основними ізоформами ITSN1. Висновки. Отримані дані свідчать про те, що альтернативний промотор, локалізований у 5-му інтроні гена ITSN1 людини, функціонує як слабкий промотор. Подальші дослідження необхідні для з’ясування функції транскриптів ITSN1 з альтернативним 5'-кінцем.; Ген интерсектина 1 (ITSN1) кодирует эволюционно консервативный адаптерный белок, участвующий в клатрин-опосредованном эндоцитозе, внутриклеточной передаче сигнала, апоптозе и реорганизации цитоскелета. Его экспрессия характеризуется многочисленными событиями альтернативного сплайсинга. Дополнительным способом достижения разнообразия и тонкой регуляции экспрессии генов является использование альтернативных промоторов. Цель данной работы состояла в обнаружении возможных альтернативных промоторов гена ITSN1. Методы. Применены компьютерное предсказание, 5' RACE, RT-PCR и тест, основанный на анализе экспрессии репортерного гена. Результаты. Нами выявлен альтернативный промотор гена ITSN1 человека, локализованный в 5-м интроне, в результате использования которого образуются транскрипты с открытой рамкой считывания и консенсусной последовательностью Козак, способные кодировать изоформы ITSN1 без первого ЕН-домена. Показано, что участок, находящийся за 246–190 п. н. до начала 6-го экзона, необходим для функционирования альтернативного промотора. Транскрипты ITSN1, полученные с альтернативного промотора, обнаружены в тканях почек, печени, легких и мозга человека, но уровень их экспрессии значительно ниже по сравнению с основными изоформами ITSN1. Выводы. Полученные результаты свидетельствуют о том, что альтернативный промотор, локализованный в 5-м интроне гена ITSN1, функционирует как слабый промотор. Дальнейшие исследования необходимы для выяснения функции транскриптов ITSN1 с альтернативным 5'-концом.