Надмолекулярная организация и активность киназы легких цепей миозина гладких мышц

Abstract

Киназа легких цепей миозина (КЛЦМ) играет ключевую роль в механизмах регу­ляции сокращения гладких мышц. Полученные нами с помощью лазерной корреля­ционной спектроскопии данные позволяют утверждать, что неактивированная КЛЦМ из гладких мышц в растворе в условиях близких к физиологическим, существует в виде смеси олигомерных и димерных частиц с гидродинамическими диаметрами – 150 и 20 нм соответственно. Эти частицы очевидно находятся в динамическом равновесии. Мы не обнаружили заметных изменений в распределении различных форм киназы в растворе после ее активации при избытке как киназы, так и кальмодулина (СаМ). При значительном избытке киназы по отношению к СаМ ее активность через 5–10 мин уменьшается в несколько раз. По-видимому, наблюдаемое ингибирование ки­назы перед добавлением субстрата связано с медленными конформационными изме­нениями активированных молекул киназы, о чем свидетельствуют результаты про­веденных нами флюоресцентных исследований. Подобные перестройки отмечаются и при эквимолярном соотношении киназы и СаМ, однако в этом случае они характеризуются меньшей глубиной и незначительным понижением активности КЛЦМ. Мед­ленные конформационные перестройки в надмолекулярных структурах активированной киназы. скорее всего имеют коллективный характер и связаны с усилением взаимного влияния между молекулами киназы. приводящего к ослаблению связывания Са²⁺-СаМ. В качестве рабочей гипотезы можно предположить, что в надмолекулярных комплек­сах активированной киназы устанавливаются взаимодействия псевдосубстратного участка одной молекулы t активным центром соседней с возникновением стерических препятствий для связывания СаМ.

Кіназа легких ланцюгів міозина (КЛЛМ) відіграє ключову роль у механізмах регу­ляції скорочення гладеньких м'язів. Отримані нами за допомогою лазерної кореля­ційної спектроскопії дані дозволяють стверджувати що неактивована КЛЛМ із гла­деньких м'язів у розчині за умов, близьких до фізіологічних, існує у вигляді суміші олігомерних і димерних частинок з гідродинамічними діаметрами –150 і 20 нм від­повідно. Ці частинки, очевидно, знаходяться у динамічній рівновазі. Ми не виявили помітних змін у розподілі різних форм кінази у розчині після її активації як при надлишку кінази, так і кальмодуліну (СаМ). При значному надлишку кінази відносно СаМ її активність через 5–10 хв. зменшується у декілька разів. Може бути, що спо­стережене пригнічення кінази перед внесенням субстрата пов'язане з повільними конформаційнимн змінами активованих молекул кінази, про що свідчать результати здійснених нами флюоресцентних досліджень. Подібні перебудови відмічаються і при еквімолярному співвідношенні кінази і СаМ, проте в цьому випадку вони менш глибокі і характеризуються незначним зниженням активності КЛЛМ. Повільні конформаційні перебудови в надмолекулярних структурах активованої кінази, скоріш за все, мають колективний характер і пов'язані з підсиленням взаємного впливу між молекулами кінази, який призводить до ослаблення зв'язування Са²⁺ -СаМ. Спира­ючись на вищевикладене, можна припустити, що у надмолекулярних комплексах активованої кінази мають місце взаємодії псевдосубстратної ділянки однієї молекули з активним центром сусідньої, що супроводжується появою стеричних перешкод для зв'язування СаМ.

The data received by the use of lazer correlation spectroscopy (LCS) suggest that inactive MLCK under conditions close to the physiological exists as mixture of oligomeric and dimeric particles with hydrodynamic diameters about 150 and 20 nm, respectively. These particles should be in dynamic equilibrium. We could not discover noticeable alteration in different kinase species distribution at both kinase or calmodulin excess in solution. At considerable excess of kinase over calmodulin the activity of the former is decreased several times after 5 to 10 min from the moment of its activation. Observed kinase inhibition in the preincubation time (before addition of substrate) must be connected with slow conformational rearrangements of activated kinase molecules which is directly confirmed by the results of our fluorescent studies. Such conformational rearrangements accompanied by the reduction of MLCK towards CaM affinity take place also at equimolar ratios of kinase to CaM, but in this case they are characterised by the lesser depth and insignificant MLCK activity decrease. Slow conformation changes in supramolecular structures of activated kinase are believed to have collective character and to be connected with intensification of mutual influence of kinase molecules leading to reduction of CaM binding.