Характеризація очищеної рекомбінантної субодиниці В дифтерійного токсину як інструмента його дослідження

Abstract

Очищення препаратів рекомбінантної субодиниці В (SbB) дифтерійного токсину (DT), синтезованої в цитоплазмі, периплазмі і нерозчинних тільцях включення клітин Escherichia coli, проведене за допомогою металоафінної хроматографії після руйнування бактеріальної ДНК та клітинної стінки ензимами, дало можливість позбутися домішок ендогенних пороформуючих протеїнів. Показано, що рекомбінантні похідні DT, SbB та CRM197 мають однакову спорідненість з рецепторами чутливих та резистентних до токсину клітин ліній Vero і L929 відповідно. Прикладання позитивного потенціалу з боку додавання SbВ (0,3 мкг/мл) до фосфатидилетаноламінвмісної бішарової мембрани у розчині 1 M KCl (pH 4,8) призводить до утворення потенціалозалежних іонних каналів з провідністю 20 пСм, як показано у класичних дослідженнях природного DT. За даними порівняльного аналізу, характеристики утворення і функціонування каналів DT найкраще відтворюються SbB, синтезованою в неактивній формі у вигляді тілець включення, та ренатурованою in vitro.

Очистка препаратов рекомбинантной субъединицы В (SbB) дифтерийного токсина (DT), синтезированной в цитоплазме, периплазме и твердых тельцах включения клеток Escherichia coli, проведенная с помощью металлоаффинной хроматографии после разрушения бактериальной ДНК и клеточной стенки энзимами, позволила удалить примеси эндогенных пороформирующих белков. Показано, что рекомбинантные производные DT, SbB и CRM197 имеют одинаковое сродство с рецепторами чувствительных и резистентных к токсину клеток линий Vero і L929. Приложение положительного потенциала со стороны добавления SbВ (0,3 мкг/мл) к фосфатидилэтаноламинсодержащей бислойной мембране в растворе 1 M KCl (pH 4,8) приводит к образованию потенциалозависимых ионных каналов с проводимостью 20 пСм, как показано в классических исследованиях DT природного происхождения. Согласно данным сравнительного анализа, характерное для DT образование и функционирование каналов лучше воспроизводятся SbB, синтезированной в неактивной форме в виде телец включения, и ренатурированной in vitro.

The purification of recombinant diphtheria toxin (DT) derivative, fragment or subunit B (SbB) synthesized in cytoplasm, periplasm, and solid inclusion bodies of E.coli, by metal-affinity chromatography following the enzymatic digestion of bacterial cell walls and DNA allowed us to avoid the contamination by endogenous poreforming proteins. The recombinant DT derivatives, SbB, and CRM197 are shown to bind the receptors of DTsusceptible cells Vero and non-susceptible cells L929 with equal affinity. The introduction of SbB (0.3 μg/ml) at positive voltages from the side of a phosphatidylethanolamine-containing bilayer membrane, where the derivative was added, results in the creation of potential-dependent ionic channels with the conductance of 20 pS in the bathing solution of 1M KCl buffered at pH 4.8 as had been shown in the classic studies of wild-type DT. The comparative analysis has shown that the channel-forming abilities of wild-type DT are best reproduced by SbB synthesized in the non-active form of inclusion bodies and renaturated in vitro.